原位杂交技术原理及其应用PPT.ppt

原位杂交技术 in situ hybridization;核酸分子杂交技术;固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上（常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交包括： 菌落原位杂交（colony in situ hybridization）、 斑点杂交（Dot blot）、 Southern印迹杂交（Southern blot） Northern印迹杂交（Northern blot） 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术;原位杂交技术的基本原理;;用原位杂交术，可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。 此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水来探讨细胞的功能表达及其调节机制。已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。 ;培养细胞;原位杂交组织化学技术发展;由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。 Bauman（1981）等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。 Shroyer（1982）报道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。 这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高，应用不够普遍。　　;Pezzella（1987）创建了用磺基化DNA探针来做细胞或组织原位杂交的方法，其基本原理是使DNA探针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆抗体识别磺基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。 本法的优点是磺基化DAN探针标记简便，不需作缺口平移标记，敏感度也较高。 生物素标记探针技术是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位。 生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。;上述生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。另一种叫光促生物素标记核酸技术（1985） ，该技术是用光敏生物素（Photobiotin）标记核酸。目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素生物素，它们都是由三个部分组成：光敏基团、连结臂和生物素。在强光下，不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。 光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每100～150个碱基才能标记一个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度。;近年来，地高辛（Digoxigonin）标记技术引起科技工作者的极大兴趣。Boeringer Mannhem Bio－chemisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。 和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，可以检测出人基因组DNA中的单拷贝基因。地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色（标记碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色系统），有较好的反差背景。;核酸探针的分类;早期应用的主要是DNA探针 Temin在70年代研究致癌RNA病毒时制备了cDNA探针（complementary DNA），其基本原理是以RNA为模板，经逆转录酶（reverse transcriptase）又称为RNA指导的DNA聚合酶催化产生的。该酶以RNA为模板，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA，这一途径与一般遗传信息流的方向相反，故称逆转录。cDNA是指互补于mRNA的DNA分子。;RNA探针是将特异性的cDNA片段插入含有RNA聚合酶启动子的转录性载体。 这类载体包括pSP64和pSP65，它们具有不同的启动子在多克隆位点的各侧。Psp64和pSP65在sP6启动子的多克隆位点的方向是不同的。通过改变外源基因的插入方向或选用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的转录方向，即以哪条DNA链为模反转录RNA。从而可以得到与mRNA同序列的同义RNA探针（Sense probe）和与mRNA互补的反义RNA探针（antisense probe），又称互补RNA探针（complementary RNA probe , cRNA）。 通常用同义RNA探针做为反义RNA探针的阴性对照。 由于RNA探针是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应极高。有报告认为其杂交率高于DNA探针的8倍。;DNA合成仪的诞生使制造寡核苷酸探针成为可能，