沉淀法-生物分离工程.ppt

生物分离过程的一般流程 沉淀分离－学习要点 识记：盐析和盐溶概念 理解：蛋白质凝集沉淀的屏障，各种沉 淀方法的原理和影响因素 应用：采用不同的试剂方法实现蛋白质 的沉淀 沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。 沉淀法的目的： 通过沉淀达到浓缩的目的； 沉淀方法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，初步 纯化 ； 将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。 沉淀与结晶的区别 沉淀生成的固体颗粒是不定形的 结晶产品为单一组分，而沉淀凝聚物则成分非常复杂（除了目标产物外，还夹杂着多种共存的杂质、盐和溶剂等） 沉淀的纯度远低于结晶 多步沉淀操作也可获得高纯度的目标产品 沉淀法的原理： 生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。 沉淀法基本原理就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的， 溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。 概述 沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。 操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行： 概述 沉淀法操作步骤 ： ①首先加入沉淀剂， ②沉淀剂的陈化，促进粒子生长； ③离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。 沉淀生成动力学 溶解度值的降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚并作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起： ①热运动，Bromnian运动； ②对流运动，由机械搅拌产生； ③差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。 沉淀生成动力学 为了简化沉淀过程动力学， 可把沉淀过程分成下述６个步骤： (1) 初始混合 (2) 新相生成 (3) 布朗运动凝集 (4) 机械碰撞凝集 (5) 聚集体陈化 (6) 聚集体沉淀 沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且易于放大，也广泛用于生产的制备过程， 是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。 优点：操作简单、经济、浓缩倍数高 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强 沉淀法的分类 根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： （1）盐析法； （2）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法； （4）非离子型聚合物沉淀法； （5）聚电解质沉淀法； （6）复合盐沉淀法等 （7）亲和沉淀法 （8） 选择性沉淀法。 3.1蛋白质表面特性－蛋白质组成 蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域 胶体的定义 胶体是一种尺寸在1～100 nm以至1000 nm的分散体。它既非大块固体，又不是分子分散的液体，而是具有两相的微不均匀分散体系。 -《被遗忘了尺寸的世界》 胶体的性质 比表面增大，界面现象重要 强烈的尺寸效应 蛋白质表面特性－蛋白质性质 蛋白质的胶体性质 蛋白质的分子量约6～1000 kDa，分子直径约为1~30 nm。在此粒径范围内，蛋白质可视为胶体，并表现出胶体溶液的部分性质 蛋白质的两性电离和等电点 蛋白质两端及侧链中有一些解离基 ，解离程度受pH影响。 蛋白质的变性 物理因素：加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波的作用等； 化学因素：有强酸、强碱、尿素、重金属盐、SDS等。 蛋白质表面特性－沉淀屏障 蛋白质分子周围的水化层 水溶液中蛋白质可视为胶粒，其周围存在着稳定的水化层 胶粒外的这部分水客观上起排斥作用，称为“水化层斥力” 分子间的静电排斥作用 根据扩散双电层理论，胶粒是带电的，其表面吸附相反电荷的反离子，这些位于胶粒周围过量的反离子好像胶粒四周为离子氛所包围。 当两个胶粒（蛋白质）趋近而使离子氛发生重叠时，处于重叠区内的反离子浓度较大，从而破坏了原有电荷的对称性，引起离子氛中电荷重新分布，即离子从浓度较大的重叠区向未重叠区扩散。这种扩散的结果就是胶粒受到斥力而相互脱离。 蛋白质表面特性－沉淀策略及方法 策略 破坏蛋白质四周水化层 降低双电层厚度 沉淀方法 改变溶液pH值 加入无机盐或改变无机盐