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沉淀法 (precipitation) 一、概述 概述 沉淀法的分类 二、蛋白质的溶解特性 二、蛋白质的溶解特性 蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域 防止蛋白质凝聚沉淀的屏障 三、蛋白质盐析 蛋白质盐析 用盐析法分离蛋白质的二种方法 阴阳离子盐析效果 盐析操作(加盐方式） pH值和温度对盐析的影响 β值随pH值变化 右图表示大豆蛋白的溶解度随pH的变化情况。 等电点沉淀法适用于憎水性较强的蛋白质，例如酪蛋白在等电点时能形成粗大的凝聚物。但对一些亲水性强的蛋白质。如明胶，则在低离子强度的溶液中，调 pH在等电点并不产生沉淀。 所以其很少单独使用，往往与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀法一起使用。 有机溶剂沉淀法 不同溶质的介电常数 水 80 20％乙醇 70 40％乙醇 60 60％乙醇 48 100％乙醇 24 2.5mol/L甘氨酸 137 5 mol/L尿素 91 丙酮 22 甲醇 33 乙醇、丙酮的介电常数都很较低，是最常用的沉淀用溶剂。2.5mol/L甘氨酸的介电常数很多，可以作为蛋白质等生物高分子溶液的稳定剂。 乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析； 丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广； 优点： 分辨率比盐析法高，溶剂容易除去并可以回收。 缺点 是易使酶等生物大分子变性。 使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行，以减少蛋白质的变性。 影响因素 温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）； 搅拌速度：散热 溶液pH值：原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的电荷，防止共沉现象。（pI） 离子强度：离子强度低有利于沉析，0.01~0.05mol/L 样品浓度： 0.5~2% 稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小 浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低 金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+ 非离子型聚合物沉淀法 聚电解质沉淀 金属离子沉淀 机理 金属离子沉淀蛋白质 选择性变性沉淀法 选择性变性沉淀法 选择性溶剂沉淀法 选择性溶剂沉淀法 沉淀法应用 利用蛋白质沉淀大规模提纯白蛋白与免疫球蛋白的工艺 柠檬酸的生产 新工艺的主要种类 萃取 一沉淀法提取分离茶多酚 茶多酚不仅是一种新型的天然抗氧化剂，还具有明显的抗衰老、消除人体过剩的自由基，去脂减肥，降低血糖、血脂和胆固醇，预防心血管疾病，抑制肿瘤细胞等药理功能，在食品加工、医药、日用化工等领域具有重要的应用。茶多酚的提取和应用受到国内外的广泛关注，开拓了茶叶化学研究的新领域，发展以农副产物为原料的精细化学品，开发“绿色技术”，发展“绿色工程”已成为热门课题。 儿茶素类化合物是茶多酚的主要成分，其结构式可表示为 ： 茶 多 酚 沉淀法的一般工艺路线 萃取法和沉淀法提取茶多酚工艺图 思考题： 生物分离工程精品课程 ★在调节等电点时，如果采用盐酸、氢氧化钠等强酸强碱，要注意防止酶的失活或蛋白变性。 为了使pH缓慢变动，也可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸钠等弱碱。 ★ 定义：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法，称为有机溶剂沉淀法 机理: A 介电常数降低，溶质之间的静电引力增加，聚集形成沉淀 B 有机溶剂的亲水性强，它会抢夺本来与亲水溶质结合的自由水， 优点： 1. 室温 2. 颗粒大，易于收集 3. 提高蛋白质的稳定性 4. PEG 难去除 机理：PEG 分子从溶剂排斥蛋白质，优先水合。 用聚乙二醇等非离子性聚合物沉淀生化物质简单有效，生化物质容易保持生物活性。 常用的沉淀剂有PEG2000、PEG4000、PEG6000。 机理：静电与架桥 聚丙烯酸（pH 2.8 90%蛋白沉淀） 聚甲基丙烯酸 聚乙烯亚胺 聚苯乙烯季胺盐（pH 10.4, 95% 蛋白沉淀） 金属离子在蛋白质分级沉淀上的应用可以追溯到1905年，当时已观察到了金属离子对蛋白质溶解度的影响，但是，真正的认识是后来从金属离子与纯血浆蛋白的特异相互作用的研究中得到的。实验利用低浓度的锌和钡与冷乙醇的浓度或用量来提高血浆分级分离的质量和选择性，并使溶剂分离蛋白质的操作更易控制，最后发展为用锌或其它金属离子完全取代乙醇。 金属离子的沉淀作用是由于它们能与蛋白质分子中的特殊部位起反应造成的。例如锌易与組胺酸残基中咪唑基结合，使蛋白质的等电点转移，从而降低蛋白质的溶解度。 近年来对于金属离子沉淀蛋白质的概念有所扩大，这是因为有些蛋白质不能为游离的金属离子所沉淀，而是需要使用它们的双螯合物与基因工程的聚組胺酸肽段相结合，从而使蛋白质沉淀。 一般可分三类： ①能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的一些金属离子，如：Mn2+.Fe2+ .Ｃo2+.N