药学中的生物技术和方法抗体和免疫分析教材.pptVIP

RIA Assay 免疫竞争结合分析---小分子抗原分析的基本方法 Ag + Ab AgAb + Ag + * Ag * AgAb + * Ag [*AgAb: Precipitant↓] 放射性计数 常用分离沉淀技术 盐析法：饱和硫酸铵、硫酸钠 聚乙二醇法（w=6000） 特点： 快速，价廉，来源方便，受环境影响大 抗体免疫沉淀法 特点： 分离完全，非特异结合小，环境影响小，效价高，但成本高 固相吸附剂 RIA测量步骤 恒量的* Ag、Ab加入反应管中 加入待测样品、或标准品（已知浓度） 37℃或4 ℃温育 加入分离剂分离结合及游离部分 测定以总放射性为分母，测定* AgAb 为分子，计算结合%，以结合率为纵坐标，浓度为坐标，制作标准曲线 待测样品的结合率从标准曲线上求出浓度 Calibration curve ELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay） Sandwich ELISA 竞争法（略） High Convenience High Sensitivity 96-well plate 包被 封闭 结合 显色 酶标仪测定 hv 洗涤 洗涤 洗涤 终止 II -免疫分析法Immunoassays 抗体 ---生物体自造的“magic bullet” 医 疗 直接或与毒素连结攻击 病变細胞 研 究 各种免疫分析 Antibody and structure 特点：2个基因决定一个蛋白质 与抗原的结合力强，高度专一性 抗原和抗原决定簇 一个抗原分子上可能有数个抗原决定簇 每個 抗原决定簇至少誘生一种专一性抗体 蛋白质抗原的决定簇含有六个以上氨基酸  ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????。? 克隆选择学说 单抗和多抗 多克隆抗体（polyclonal antibody）指由不同B细胞产生的针对多种抗原决定簇的多种抗体混合物，如免疫血清。 单克隆抗体（ monoclonal antibody）指由一种 B 细胞生产，针对某一抗原决定簇的单一抗体。 Preparation of polyclonal antibodies 传统抗血清 抗 原 免 疫 混合抗体 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 免疫前要先把抗原作成乳剂 约在两月內 注射五到八次 Preparation of monoclonal antibodies Immunoassays The most important biological assays for: Identification of proteins and small bio-molecules Quantification for complex biological sample without separation Powerful separation High sensitivity, specificity and accuracy 抗体的标记方法 放射性同位素标记 酶标记 荧光标记 有机分子荧光标记 绿色荧光蛋白标记 稀土荧光标记 通用标记 放射性碘标记 HRP酶标记 简单化学偶联方法： 1．过碘酸钠法：　　仅用于HRP的标记。HRP是一种糖蛋白，过碘酸钠可将与酶活性无关的多糖羟基氧化为醛基，再与抗体蛋白的游离氨基结合，结合反应后，再加人硼氢化钠(NaHB4)还原后，形成稳定的HRP—CH2—NH—IgG酶标记物。为防止酶蛋白氨基与醛基反应发生自身偶联，常在标记前知用二硝基氟苯(DNFB)封闭酶蛋白上的α和ε氨基。　 2．戊二醛交联标记法：　　戊二醛具有两个活性醛基，分别与酶分子和抗体分子上的氨基结合。 NaHB4 HRP Labeling with isoFITC GFP labeling GFP gene ScFv gene Vector expression GFP gene Protein A gene Vector expression Ab-Fc 通用标记 + Avidin/streptA + Anti-digoxin Ab 2nd Ab Protein A Primary Ab Primary Ab Important assays Immunostaining Western blot Fluorescent microscopy Quantification of immunos