[医学]第三章+细胞融合与单克隆抗体.pptVIP

第六章 细胞融合 与 单克隆抗体 Cell Fusion and Monoclonal Antibodies 6.1.1 细胞融合 细胞融合：指用自然或人工方法、使两个或更多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。 6.1.1 细胞融合 融合细胞有两类：一类多核细胞中含有来自同一种亲本的核，这样的融合细胞称为同核体(homokaryon)；而另一类融合细胞中含有分别来自两个亲本的核，被称为异核体(heterokaryon) 。 6.1.1 细胞融合 细胞杂交(cell hybridization)特指用人工方法把不同类型的两个或两个以上细胞合并成一个细胞的技术。细胞杂交所得到的融合细胞叫杂交细胞(hybrid cell)或细胞杂交体(cell hybrid) 。 种内杂交细胞 种间杂交细胞 6.1.2 人工诱导细胞融合 病毒诱导细胞融合 疱疹病毒、牛痘病毒和副粘液病毒 化学方法诱导细胞融合 物理方法诱导细胞融合 6.1.2.1 聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合 原理：PEG带有大量的负电荷,和原生质体表面的负电荷在钙离子的连接下，形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高pH,高钙离子的溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。 影响因素： 分子量：400—6000（通常：1000—4000） 浓度： 20—60% （通常：30—50%） 时间： 3—5 min pH： 偏碱为宜（pH7.4—8.0） 6.1.2.2 细胞电融合 原理： 使细胞在正弦电场下极化成偶极子，并向两极靠近；在向两极靠近的过程中，有些细胞彼此吸引连接在一起，成串排列在两极之间；然后，施加以高强度、短时程的电波刺激，把相互连接的两个或更多细胞的质膜击穿而导致细胞融合。 甜菜原生质体电融合过程 电融合优点： 融合率高，达70％－80％，甚至100％ 融合率＝（融合组多核细胞的核数－对照组多核细胞的核数/对照组的全部细胞数）×100％ 可在显微镜下定向诱导细胞融合 可直接挑选杂种细胞 可以直接转入培养 6.1.2.3 细胞融合机制 细胞凝集→质膜融合→ 胞质融合→细胞核融合 6.1.3 杂种细胞的筛选 原理：两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。 植物细胞筛选方式 1）遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。 如亲本1：叶绿体缺陷型 亲本2：光致死型 两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白 色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长 2）抗性互补筛选法：利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。 如： 亲本1：对放线菌素D抗性，但在MS培养基上不能超过50个世代 亲本2：对放线菌素D很敏感，但能在MS上生长 杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上生长，而亲本和其它细胞死亡 3）利用物理特性筛选法：根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。 亲本1：用异硫氰酸荧光素染色原生质体 亲本2：叶肉细胞原生质体 在荧光显微镜下，亲本1为红色，亲本2为绿色，杂种细胞可以区分 4）利用生长特性筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。 例如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源激素才能生长，但其融合细胞可以产生内源激素，在培养基上不需加激素。 动物细胞的筛选方式： 1）利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。 亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉素不敏感 亲本B：对卡娜霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感 杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长 2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。 亲本A：色氨酸缺陷型 亲本B：苏氨酸缺陷型 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。 3）温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。 亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。 亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡娜霉素。 杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生长。 6.2.1 杂种细胞在细胞生物学研究中的应用 1）基因定位 不同种属的细胞融合时，常会出现一个亲本细胞的染色体被优先排除，而另一个亲本的染色体被选择性留下，即染色体分离的现象。由此，可根据表型和