浅谈植物组织培养中的污染问题与防治措施.DOC

浅谈植物组织培养中的污染问题与防治措施 李建忠 （广西职业技术学院农业技术工程系02应生班） 摘要：植物组织培养过程中的每一个环节，都应该谨慎操作，否则随时都有可能造成污染从而影响到实验的成功与否和大规模生产的顺利进行。污染通常是由于培养容器，操作器械和培养基的不干净或消毒灭菌不彻底；接种环境和培养环境不清洁；操作人员操作不慎以及培养材料消毒不过关或携带内生菌等因素引起的。本文将针对以上几方面介绍相关的防治措施，来减少污染问题的发生。 关键词：组织培养，污染，防治措施，消毒灭菌。 植物组织培养过程中，污染问题是一个普遍存在的现象。能否很好地解决污染问题，关系到实验的成功与否和大规模生产的顺利进行。所谓污染是指在培养过程中由于外界真菌，细菌或培养材料的内生菌所侵染，而使培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。污染来源主要分为外界污染和内部污染两种。具体原因可分为：①培养容器、操作器械和培养基的不干净和消毒灭菌不彻底；②接种环境和培养环境不清洁；③操作不谨慎；④外植体消毒不过关；⑤培养材料携带内生菌。针对以上污染源，现将各相关防治措施分别介绍如下： 1． 培养容器、操作器械和培养基不干净与消毒灭菌不彻底 1．1 培养容器的清洗 植物组织培养过程中，用于培养的容器有试管、三角瓶、培养瓶和培养箱等。目前主要以培养瓶的使用为主。对于培养瓶的洗法，根据桂林莱茵应用生物科技有限公司和加好生物工程有限公司的经验，先将瓶内的培养基去掉，然后置于淡洗衣粉水中浸泡一定时间，再在浓洗衣粉水中涮洗。涮洗时要认真，瓶内瓶外都要涮洗到不能遗漏任何一处。最后在流动的自来水下将残留的洗衣粉泡沫冲洗掉。洗后的瓶子应明亮，内壁水膜均一，不挂水珠。将洗干净的瓶子倒放在盘中或筐内，滤干水后，置于干净、明亮、干燥的地方备用。需要注意的是，应将未污染的与污染的分开来洗。先洗未污染的，再洗污染的。并且分开放，以免造成交叉污染，而加重下一步的灭菌工作。 而对于瓶盖，也应严格的用洗衣粉水来认真涮洗，凉干后与瓶子一起存放备用。 1．2 操作器械的消毒灭菌 对于无菌操作所用的各种器具，如镊子、剪刀、解剖刀、接种盘、烧杯和玻棒等，在使用前应先将其用牛皮纸包好，放入高压灭菌锅内在压力为1.1kg/cm2,121℃下灭菌20min即可达到杀菌目的。或将这些器具用锡箔纸包好放入烘箱内，在160~180℃下处理3h进行干热灭菌，也可以达到灭菌效果。目前，许多公司在接种时采用焚化炉，可把镊子、剪刀等直接插入焚化炉灭菌。需要注意的是，每操作完一次都应该将器具重新插入焚化炉灭菌或用95%酒精灼烧灭菌，放凉后再使用。 而脱毒培养时所用到的显微镜，因不能进行高温高压灭菌，所以只能用75%的酒精来仔细擦洗显微镜的表面，然后将其放在操作台上开紫外灯来照射杀菌。 1.3 培养基的灭菌 培养基的灭菌，一般采用高压蒸汽灭菌法。当灭菌压力达到0.5kg/cm2时，打开排气阀排气，等排气完后，再关闭排气阀继续加热。待压力上升至1.1kg/cm2，121℃时，维持15-20min，切断电源排气即可。装锅时不可装得太满，以免影响蒸汽流通，对灭菌效果不好。经实践表明，在压力达到0.5kg/cm2时，排气两次比排气一次效果好。 2． 接种室和培养室的清洁消毒 2.1 接种室的清洁消毒 接种室污染的主要原因是空气中的真菌孢子和细菌。每次接种前，需开紫外灯杀菌20min。其中莱茵公司还配有专门的杀菌机。接种完后，需进行清扫，拖地板等清洁工作。并定期用新吉尔液拖地板，用75%酒精清擦工作台，以及用甲醛和个高锰酸钾混合熏蒸杀菌，来尽量使接种室干净，不含或少含杂菌。 在接种室的设计上，要求地板、天花板以及四壁尽可能地光滑清洁，不易积染灰尘，易于采取各种清洁和消毒措施。配有缓冲间，以方便与在此换上经过灭菌处理的工作服和鞋子。配置水平拉门，以减少空气的扰动。并按其空间大小，在工作室和缓冲间适当安装紫外灯的个数，以便合理地杀菌。 2.2 培养室的清洁消毒 培养室的污染原因与接种室一样，都是由空气中的真菌孢子和细菌造成的。所以培养室在设计上一样要求干净、光洁，不易积染灰尘，易于采取各种清洁消毒措施，并尽量安排在高处，以减少尘埃和杂菌污染的机会。在闷热封闭环境下，污