第三章　基因工程中常用的酶1.ppt

基因工程中常用的酶 基因的剪刀 ----------------限制性内切酶 第一节 限制性核酸内切酶 (Restriction enzyme) 核酸酶（P41-42) 核酸外切酶 核酸内切酶 限制性核酸内 切酶 一. 限制与修饰: 1962年 Arber, W. (瑞士) 等 提出限制与修饰假说。 1968 Meselson和Yuan 发现Ⅰ型限制性酶。 1968 Smith和Wilcox 发现了Ⅱ类限制性酶并阐明其性质。 1971 Nathans等首次制作酶切图谱。 因他们发现了限制性酶并应用于分子遗传学而获1978年度诺贝尔生理学和医学奖。 1962 , Arber, 1968 Smith等 发现限制性酶 二.限制性内切酶的类型（P44） 基因工程中最常用的是Ⅱ型酶 三. Ⅱ型酶的命名,书写与剪切方式： 限制酶 来源 剪切方式 Eco R I Escherichia coli RY 13 G↓AATTC Pst I Providencia stuartii 164 CTGCA↓G BseⅡ Bacilus stearothermophilus strain 822 (HpaⅠ) GTT↓AAC Cla Ⅰ Nco Ⅰ Nde Ⅰ Not Ⅰ Sac Ⅰ Xba Ⅰ Xho Ⅰ Ⅱ型内切酶识别位点序列中心对称 酶切位点及酶切未端 平未端 EcoR Ⅴ (5’ ··· GAT^ ATC ··· 3’) Hinc Ⅱ(5’ ··· GT(T/C) ^ (A/G)AC ··· 3’) Hind Ⅱ(5’ ··· GT(T/C) ^ (A/G)AC ··· 3’) Sca Ⅰ (5’ ··· AGT ^ ACT ··· 3’) Sma Ⅰ (5’ ··· CCC ^ GGG ··· 3’) 具5‘突出未端的粘性未端 BamH Ⅰ (5’ ··· G ^ GATCC ··· 3’) EcoR Ⅰ (5’ ··· G ^ AATTC ··· 3’) Hind Ⅲ (5’ ··· A ^ AGCTT ··· 3’) Nco Ⅰ (5’ ··· C ^ CATGG ··· 3’) Nde Ⅰ (5’ ··· CA ^ TATG ··· 3’) Not Ⅰ (5’ ··· GC^ GGCCGC ··· 3’) SalⅠ (5’ ··· G^ TCGAC ··· 3’) XbaⅠ (5’ ··· T^ CTAGA ··· 3’) XhoⅠ (5’ ··· C^ TCGAG ··· 3’) KpnⅠ (5’ ··· GGTAC^ C ··· 3’) PstⅠ (5’ ··· CTGCA^ G ··· 3’) SacⅠ (5’ ··· GAGCT^ C ··· 3’) 同裂酶 识别同一序列且在同一位置(有时不)切割DNA的内切酶称为同裂酶 Hinc Ⅱ(5’ ··· GT(T/C) ^ (A/G)AC ··· 3’) Hind Ⅱ(5’ ··· GT(T/C) ^ (A/G)AC ··· 3’) Sma Ⅰ (5’ ··· CCC ^ GGG ··· 3’) Xma Ⅰ (5’ ··· C ^ CCGGG ··· 3’) DNA甲基化与RE 两类甲基化: dam甲基化和dcm甲基化 原核生物有两类甲基化, 真核生物只有dcm甲基化 有些工程菌株是甲基化缺陷的 Dam: 5’ – GATC – 3’, A’s N6 Dcm: 5’ – CCAGG – 3’, 5’ – CCTGG – 3’, C’s C5 (/N4) 对Dam 敏感的内切酶: MboI (GATC), Taq I (TCGm6ATC), XbaI 对Dam 不敏感的内切酶: Sau3A I(GATC), Bsp143 I (GATC), BamH I, Bgl II 对Dcm 敏感的内切酶: EcoR II (CCWGG) 对Dcm不敏感的内切酶: Mva I (CCWGG), BamH I, Kpn I 限制酶的识别序列与DNA的切割（P47） 限制酶的识别序列与DNA的来源无关，不具有种的特异性； 限制酶识别序列的长短涉及对DNA分子切割的频率，可以从理论上推导酶切DNA片段的大小 识别位点： 4个碱基：44 = 256 　　　　　　 6个碱基：46 = 4096 　　 限制酶识别序列的相邻序列效应（P48）：即大多数限制性内切酶对只含识别序列的寡核苷酸没有催化活性，需在两侧各延长一个或几个