[医学]C12 基因功能分析的基本策略.pptVIP

第十二章基因功能分析的基本策略 21世纪的研究热点领域 特定基因的功能研究 对模式生物的研究 基因敲除动物模型，转基因动物模型，基因转染细胞模型，RNA干扰技术 基因组功能预测 用最大相似得同源基因的功能注释咨询序列 用功能相关的保守序列模体进行搜索 用直系同源体簇中的已知基因注释未知基因的功能 第一节 利用转基因模型研究基因的功能 转基因技术是指将外源基因导入受精卵细胞或胚胎干细胞中，通过外源基因与细胞染色体DNA间随机重组的发生而将外源基因导入到受体染色体DNA中，并随着细胞的分离而遗传给后代，以这种方式可以制造转基因动物模型 细胞水平的转基因 一、利用转基因动物分析特定基因在体内的功能 转基因动物是指应用转基因技术培育出的携带外源基因并能稳定遗传的动物，将外源基因整合到动物基因组上，被称为转基因 特点 分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达 转基因动物的基本过程 基本方法 显微注射法 胚胎干细胞法(embryonic stem cells,ES细胞) 逆转录病毒感染法 精子载体法 转基因动物中外源基因的检测 染色体及基因水平：斑点杂交、Southern杂交、PCR 转录水平：Northern杂交 蛋白质水平：Western印迹 转基因动物的应用 基因特异表达的研究 发现基因的新功能 发现新基因 建立基因表达、调控的动物模型 建立人类疾病的动物模型等 转基因动物在医学及生物学领域的应用 研究特定基因在体内组织中特异表达或表达时相 研究基因在体内的功能是增强某种功能还是导致某种疾病的发生 发现基因的新功能或未知基因的功能 发现新基因 用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能的研究 建立外源基因表达、调控的动物模型 生产人体或动物进行器官或组织移植时所需的器官和组织 尚待解决的问题 转基因动物的成功率较低。 目的基因在宿主染色体的整合及其特异性表达问题。 插入突变，破坏宿主基因组功能 外源基因在宿主染色体上整合的拷贝数不等 整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的不稳定遗传等 产品纯化问题。 安全性问题。 二、通过在细胞模型中表达特定基因以确定其功能 基本程序 特定基因的克隆 将基因导入细胞使之整合到细胞的染色体DNA中 筛选高表达转染基因的细胞 第二节 利用基因敲除模型研究基因的功能 基因敲除指通过DNA同源重组定向地将外源基因插入宿主细胞染色体DNA，从而使特定基因在细胞内或生物活体内失活的过程 基因敲除动物是指通过同源重组定向地在活体内剔除特定基因地动物 基因敲除小鼠是指特定基因在两条染色体上的等位基因都丧失的小鼠 过程： 第一阶段是在小鼠胚胎干细胞（ES细胞）水平剔除染色体上的一个等位基因 第二阶段是在小鼠活体内剔除另一个等位基因 基因打靶的必备条件 胚胎干细胞(ES细胞) 能在体外培养，保留发育的全能性 打靶载体（基因敲除载体） Neo（新霉素）阳性筛选标志 HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase) 待剔除基因同源臂序列 基因敲除的基本程序 打靶载体的构建 打靶载体导入ES细胞：重组置换 基因敲除ES细胞注射入胚泡 胚泡植入假孕小鼠的子宫中 嵌合体的杂交育种 第三节 通过抑制或沉默基因表达对基因的功能进行分析研究 在RNA水平上分析基因功能的方法有两种 反义RNA封闭 mRNA的功能 RNA干涉（RNAi) 使基因处于沉默状态 利用反义RNA抑制基因表达水平 反义RNA： 指能与mRNA互补配对的RNA分子。 应用： 根据特定基因的序列设计反义RNA序列，然后通过构建反义RNA转录载体建立转染细胞模型，并研究相应基因表达产物的水平，推测基因功能是否受到干扰，也可以直接合成短的反义RNA并导入细胞中来研究基因的功能，如bcl-2基因的反义RNA治疗B淋巴瘤和白血病 利用RNAi技术在细胞中沉默特定基因以研究其功能 RNAi技术是指由短双链RNA诱导的同源mRNA的降解过程，可使基因的表达受到抑制 RNAi的发现源于两类研究，一类是转基因植物的研究，另一类是反义RNA的研究 双链RNA之所以能引起特异性基因抑制，是由于其激活细胞内的一种被称为Dicer的酶复合物所致 RNA干扰技术 利用RNAi技术研究特定基因功能的程序 确定目标RNA并选择被干涉靶点 避开蛋白质结合部位 选择目标RNA的AUG下游50～100bp区域的AA(N19)TT或AA(N21)序列，GC比在50％左右，长度在21-23nt，不超过30nt，与其他RNA序列没有同源性 准备针对目标RNA的siRNA 用siRNA干涉目标RNA 合成siRNA 的方法 化学合