[医学]第三章 细胞培养的基本方法10.pptVIP

第三章细胞培养的基本方法 无菌操作技术 实验器具和材料的准备 将所需的实验器具和材料准备好，以合适的方法进行消毒和灭菌。 培养室和超净台的消毒 每天都要用1‰新洁而灭(或2％一5％来苏儿)拖洗地面一次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30—50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗，然后紫外线消毒30min。 洗手和着装 进行操作前要更换消毒的无菌服、帽子和口罩，以75％酒精(或l‰新洁而灭)消毒手和前臂。 无菌培养操作 （1）点燃酒精灯，所有操作均应在火焰近处并经过烧灼。 （2）工作台面上的用品要有合理的布局，操作时要有条不紊，保持一定顺序性。 （3）培养板、培养瓶的使用。 （4）吸管的使用。 （5）使用超净工作台的注意事项： 1)超净工作台要安装在清洁无尘的房间内，最好为隔离好的无菌间内。 2)新安装的或长期未使用的工作台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，再采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。 3)每次使用工作台时，应用75％酒清擦洗台面，并提前以30—50min紫外线灭菌灯处理净化工作区内积累的微生物。 4)净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流型不受干扰。 5)必须经常注意工作区上方微压表的指示。当指针从绿色区进入红色区时说明高效空气过滤的容尘量趋于饱和或气流变弱，需检查超净台的过滤器。 6)每次用后需清理台面，并用75％的酒精擦洗，使台面保持洁净，以方便下次实验或其他人的正常使用。 培养细胞的观察 相差显微镜观察 1．相差显微镜的工作原理 一般情况下，人眼只能在光波的波长(颜色)和振幅(亮度)发生变化时，才能看到被检物体。但大部分生物体，特别是生活状态下的细胞都呈无色透明，光线通过这些物体时波长和振幅并不发生变化，因此用普通显微镜无法看清活细胞的形态和结构。 相差显微镜是利用细胞内部结构密度的不同而对光产生折射率有差异的原理，即光波在折射率大的物体中比在折射率小的物体中前进的距离较短，此距离差异叫光程差，由于光程差引起光的相位变化称为相位差或相差。使用相差显微镜可使用肉眼不能分辨的相位差变为可分辨的振幅差(即明暗差)，使无色透明的物体在镜下反差显著、影像清晰。 光波的衍射 2．相差显微镜的主要装置 相差显微镜与普通显微镜的差别在于用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜代替普通物镜。此外，还带有合轴调节的中心望远镜。相差显微镜对光源及滤光片要求也较高。 (1)环状光阑(ring slit) 这是由大小不同的环状孔形成的光阑，安装在聚光器的下方，光线只能通过环状光阑的透明部分。不同倍数的相差物镜要用相应的环状光阑。 (2)相板(phase plate) 在物镜的后焦面装有相板。相板可分为两部分：一部分是通过直射光的部分，叫共轭面，为半透明环状；另一部分是除共轭面以外能通过衍射光的部分，称为补偿面，位于共轭面的内外两侧。相差板上装有吸收膜及推迟相位的相位膜。相差板除推迟直射光或衍射光的相位以外，还有吸收光量使光度发生变化的作用。具有相板的物镜称为相差物镜，其外表常有“Ph”字样和4×、10 × 、20 × 、40 ×标记。 (3)中心望远镜 又称合轴调节望远镜或辅助望远镜，它的放大倍率为4～5倍。为了充分发挥相差显微镜的性能，使用时须借助中心望远镜(插入目镜筒使用)矫正环形光阑中心与相差物镜的光轴，使之完全位于一条直线。 光通过标本致密区时发生衍射，产生偏折光，相位和未受影响的直射光相比被推迟了1／4?。只有未发生偏折的的直射光可通过相位板的环形区，其它的偏折光在物镜的后焦面上产生了一个与通过相位板的环形区的光不同的1／4?的光程差。两组光在平面上成像。 如相板的环形区使直射光超前1／4?，加上开始直射光超前的1／4?，直射光共超前1／2 ?，直射光和偏折光叠加形成的合成波振幅减少，产生暗反差。 如相板的环形区使直射光滞后1／4?，加上开始直射光超前的1／4?，两者相抵直射光不发生变化，直射光和偏折光无相位变化，形成的合成波振幅增加，产生明反差。 结果未经染色的活细胞内的各种组织就可显现不同的明暗对比。相差显微镜可观察活细胞的各种活动，如细胞迁移、分裂，运动等。 光波的干涉 3．用相差显微镜观察活细胞的方法 倒置相差显微镜(inverted phase contrast microscope) （1）调光：首先是要调正显微镜的光轴。先将虹彩关至最小，使用低倍镜，让光落于视野中央。如存在偏斜现象，可转动聚光器的调节轮将其调整至中央。 （2）调焦和合轴调节： 当改用相差显微镜时，首先充分开大虹彩光阑，旋转转盘，使环形光阑的直径与光宽和使用的相差物镜相一致 4．相差物镜的选择与使用