[基础医学]第三讲 分子生物学在药理学中的应用.ppt

第三讲 分子生物学方法和体外试验在药理学与毒理学中的应用 单细胞凝胶电泳法（SCGE)荧光原位杂交技术（FISH）单链构象多态性分析（PCR-SSCP)mRNA差异显示技术（DDRT-PCR)抑制消减杂交技术（SSH）基因芯片技术转基因动物 一、单细胞凝胶电泳法 ( SCGE ) 单细胞凝胶电泳（Single-Cell Gel Electrophoresis, SCGE）：又称慧星试验（comet assay），是一项较新的电泳方法。自1978年被Rydcbert等人成功地用于检验单细胞DNA单链断裂以来，经过不断的改进，已成为一种快速、灵敏、简便的检测DNA损伤的方法，广泛地应用于DNA放射损伤、药物的遗传毒性评价、细胞凋亡鉴定等工作中。 1. SCGE的基本原理 DNA超螺旋结构 制片：首先制备细胞悬液，然后制片。常用“三明治”凝 胶：第一层，5％正常熔点琼脂糖，第二层，细胞悬液与0.5％低熔点琼脂糖混合液（10：1）,第三层，0.5％低熔点琼脂糖。 细胞裂解：碱性试验中，pH值为10～12的含去污剂的高盐溶液做溶解液，以裂解细胞。 电泳：电泳前先将玻片浸没于碱性电泳缓冲液中，使DNA解螺旋，然后进行电泳。 中和，染色：用Tris缓冲液中和凝胶后，用染色剂染色。常用染色剂有溴化乙锭、吖啶橙、碘化丙啶（PI）等。 图像分析：在荧光显微镜下观察单细胞电泳图像 （3）强度指标 用“慧星”头部中心处荧光强度与电泳 方向上一定距离处荧光强度的比值来描述DNA的损 伤；根据“慧星”尾部荧光强度将细胞分为五 类，由弱到强分别计为 0 、1 、 2 、 3 、 4 ，将100个细胞的分值加在一起表示DNA的损 伤程度，该数值与总慧星长度有较好的相关性。 特点：不同程度地反映了电泳中泳动DNA的量。 （4）“矩”类指标 “尾矩”（ tail moment ， TM ），尾部DNA占总DNA的百分比与头、尾部中 心间距的乘积。特点：优越，被广泛接受。　 二、荧光原位杂交技术 ( FISH ) 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术（in situ hybridization, ISH）的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。 1. FISH技术基本原理 通过荧光标记的已知各类DNA和RNA单链核酸探针，按照碱基互补的原则，与待检材料（组织、细胞或染色体）中未知的单链核酸（DNA、RNA）在载玻片上进行特异性结合（杂交），形成可被检测的杂交双链核酸。 2. 探针分类与标记 按结合位点分类：染色体特异性序列探针、由许多DNA 大片段组成的全染色体探针和着丝点探针 按制备方法分类：直标型探针和间标型探针 直标型探针：DNA探针直接共价连接荧光素基团；低背 景、高特异性 间标型探针：DNA探针先与某个半抗原（生物素或地高 辛）连 ，再与荧光素基团连接形成探针－ 半抗原－荧光素基团。灵敏度高 3. FISH简要操作步骤 （1）探针的制备和标记 （2）原位杂交：变性处理染色体标本和探针， 复性杂交 （3）荧光检测：直标型探针，荧光标记的卵白素；间标型探针，荧光标记的相应抗体。常用荧光标记分子有异硫氰荧光素（绿光）、罗丹明（红 光）、德州红（深红）等。 （4）荧光显微镜检测：特定波长光波激发 4. FISH 特点 (1) 避免使用放射性同位素带来的问题; (2) 荧光试剂和探针标记相对经济和安全； (3) 快速、检测信号强、杂交特性高； (4) 可同时分析中期和间期核，灵敏度高； (5) 定位的DNA序列从1kb发展到整条染色体范围； (6) 根据基因组部位不同用不同颜色标记探针，可在 同 一细胞核或中期染色体中显示不同的颜色， 可同时观察代表不同染色体区域的荧光信号 5. FISH在药理学与毒理学研究中的应用 （1）检测有丝分裂中期细胞染色体畸变 （2）检测间期细胞染色体畸变 常用间期分析方法是用特异染色体区域探针，如着丝重复序列探针进行杂交，检测染色体非整倍体异常。 5. FISH在药理学与毒理学研究中的应用 （3）哺乳动物精子非整倍体检测 是有效检测人精子遗传损