单分子对荧光共振能量转移spFRET-北京大学单分子与纳米生物学.PDF

单分子对荧光共振能量转移（spFRET ） 生物物理学系 郑晓惠 学号 一 引言 其经典公式为E=R 6 6 6 0 /(R + R0 ), R0 为能量传递达到 光谱技术是研究生物分子最常用的方法之一。在 50%的距离。选定供、受体对之后，可将R0 看作 单分子光谱（single molecule spectroscopy, SMS ） 恒量。能量转移的发生将改变供、受体的去偏振 探测技术发展以前，大多数的实验是探测分子的 程度、荧光寿命、荧光强度等，测定这些参数值 综合平均效应，得到的是由大量对象组成的一个 就可得出E 。利用R0 和实验测得的E 就可测得供 整体所表现出的平均响应和平均值，这一平均效 受体间的距离R 。用此方法测量生色团距离的方法 应掩盖了许多特殊的信息。而单分子探测可对体 被称为光谱尺，可测量1.0-10.0nm 之间的距离。 系中的单个分子进行研究，通过与时间相关过程 spFRET 是在一个生物大分子或两个相互作用的分 的探测，能实时了解生物大分子构象变化的信息。 子上标记两个不同的荧光基团。同样，当供体的 2002 年美国第46 届生物物理年会表明单分子仍是 发射光谱与受体的吸收光谱相重叠时，发生共振 生物物理学目前和今后重点发展的研究领域。主 能量转移。通过探测能量转移效率，就可确定两 要的技术手段包括生物大分子荧光光谱，单分子 点间的距离。由于相对取向和光谱重叠积分等不 荧光能量转移谱、与原子力显微镜结合进行单分 确定因素，该方法不能准确确定绝对距离。但可 子水平的分子间相互作用力的测量，以及可进行 通过监测供体-受体的相对距离变化，结合其时间 单分子操作的激光光钳，高时间分辨率的单分子 变化推测生物大分子在生命活动中的构象变化。 轨迹追踪等[1] 。由此可见，单分子荧光技术具有重 该技术不仅有非常好的静态定位能力，也能提供 要的地位。 分子内或分子间两个荧光基团在距离和方向上的 标记在生物大分子上单个荧光基团的各种特 动态变化。由于每次只观察一对供、受体系统， 性变化能够提供有关分子间相互作用、酶活性、 因此能在毫秒时间尺度内观察这些变化，从而将 反应动力学、构象动力学、分子运动自由度 具有不同能量转移效率的亚群分开。将这种方法 (molecular freedom of motion)及在化学和静电环境 扩展，可用于研究生物多聚体的组成动力学、DNA 下活性改变的信息。近年，在动态结构生物学研 限制性内切酶酶切反应，以及DNA 发夹结构的去 究领域，用单分子荧光光谱技术研究生物分子构 折叠等。 象变化的方法主要有两种：一是通过单分子荧光 三 方法 偏振的各向异性（single molecule fluorescence 1 设备 polarization anisotropy ，smFPA ）研究生物分子的 单分子荧光探测必须满足两个基本要求，一是在 构象动力学(conformational dynamics)和旋转运动 被照射的体积中只有一个分子与激光发生相互作 (rotational motions) 。另一个是单分子对荧光共振能 用；二是要确保单分子的信号大于背景的干扰信 量转移(single pair fluorescence resonance energy 号。背景信号来自于Raman 散射、Rayleigh 散射、 transfer, spFRET) ，在单分子水平测量一个分子