[理学]2009研究生分子医学实验技能实验二.ppt

五 注意事项 1 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃ ，否则温度太高会使制板变形 2 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔 3 点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多 4 Goodview有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔 5 紫外线照射不要太久 常见问题 1、提取的DNA不纯：变性不充分；关键过程反应时间过短；离心时间或速度不够。 2、提取的DNA成涂布状：操作过程中用力过猛，动作粗暴；操作系统有污染。 3、与染色体DNA分离不全；变性过程不完全；试剂配置有问题。 特点 灵敏度高：测定下限可达10－5～10－6mol/L 准确度 能够满足微量组分的测定要求： 相对误差2～5％ （1～2％） 操作简便快速 应用广泛 光学光谱区 光吸收基本定律: Lambert-Beer定律 有关光学原理 吸收光谱 在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱。 苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱 苯(254nm) 甲苯(262nm) A ? 230 250 270 入射光 透射光 反射光 被物质吸收的光 A=lg(I0/It)=kbc It I0 b dx I I-dI s 朗伯定律(1760) A=lg(I0/It)=k1b 比尔定律(1852) A=lg(I0/It)=k2c 吸光度 介质厚度(cm) * /department/biochemistry * 中山医学院 /department/biochemistry 分子医学实用技术 蔡卫斌 生 物 化 学 教 研 室 ?4 ? caiwb@ 生物化学与分子生物学教研室 生化与分子生物学技术 中山医学院 生物化学与分子生物学教研室 操作流程 琼脂糖凝胶板的制备 质粒DNA及酶切产物电泳（约1h） （10 μl）酶切操作、保温（1-3h） 质粒DNA提取原理与方法、实验操作 纯化的质粒DNA（20μl） 琼脂糖凝胶电泳结果观察 结果分析与问题讨论 9月23日 9月30日 DNA的紫外分光光度法定量测定 实验三：DNA的琼脂糖凝胶电泳 实验四：DNA的紫外分光光度法定量测定 实验三 DNA的琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳法 凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。根据制备凝胶的材料: 琼脂糖电泳 凝胶 电泳 聚丙烯酰胺电泳 一、琼脂糖凝胶电泳的功用 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。 二、实验原理： 在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 三、琼脂糖电泳分离DNA的范围 琼脂糖可以形成各种形状、大小的孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。 0.15kb 0.2kb 0.6kb 1kb 溴酚蓝 2 1.4 1 0.6 胶浓（%） 1.6kb 2kb 二甲苯青 四、电泳指示剂： 核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（ bromophenol blue, Bb ）呈蓝紫色；二甲苯晴（ xylene cyanol, Xc ）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。 五、影响凝胶电泳的因素 在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: 1、 DNA的分子大小: 　　线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比。 2、 琼脂糖浓度　　一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA