如何防止PCR污染-上海闪晶分子生物科技有限公司.PDF

如何防止 PCR 污染 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)是一种选择性体外扩增 DNA 或 RNA 片段的 方法，在微生物感染的诊断中具有重要的价值。在 PCR 扩增过程中，扩增的 DNA 产量是呈指数上 升的，经过 n 个循环的扩增，一个 DNA 分子的产量便达到 2n 个拷贝。PCR 产物一般为 1013 拷贝 /ml，取 0.1ml 即为 109 拷贝，而 1mg 人基因组 DNA 才含 1.4´106 拷贝的单拷贝基因片段，因此 使得 PCR 扩增反应具有强大的扩增能力，提高了检测的敏感性。此外，利用 PCR 反应，还能够对 感染因子实施定量分析，实时监测其在宿主体内的动态变化，有利于指导临床诊疗。正是由于 PCR 反应具有强大的扩增效率，也导致其易污染的缺点，极微量的污染便可导致假阳性结果。PCR 反 应中，主要存在三个污染源：1.标本间的交叉污染；2.实验室克隆质粒的污染；3.PCR 扩增产物 的污染。其中以第三个污染源最主要，通过下面一个例子便可认识到 PCR 产物污染的严重性。在 100ml 的反应管中可产生 1012 拷贝个分子，若将这些分子在一个标准奥林匹克游泳池 （50m´25 m ´2m）内稀释后，0.1 ml 稀释液含有 400 拷贝的扩增分子，远远超过了 PCR 扩增反应检测数个拷 贝的极限。因此，PCR 检测微量感染因子时，一定要注意产物残留污染的问题，对临床实验室尤 应如此。本文就 PCR 污染的预防、污染源的追踪及污染的处理进行分析。 一． 污染的预防 进行 PCR 操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的 PCR 污染 或杜绝污染的出现。 （一）划分操作区 目前，普通 PCR 尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管， 均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR 的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行： 1. 标本处理区，包括扩增摸板的制备； 2. PCR 扩增区，包括反应液的配制和 PCR 扩增； 3. 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。 各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR 扩增→产物 分析→产物处理。 切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。 （二）分装试剂 PCR 扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加 样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的 DNA 和其他来源的 DNA。 1 热线电话：021－5446 0832 8009881995 E-mail:master@ 网址： 1． PCR 用水应为高压的双蒸水； 2． 引物和 dNTP 用高压的双蒸水在无 PCR 扩增产物区配制； 3． 引物和 dNTP 应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。 (三) 实验操作注意事项 尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因 此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意。 1. 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套； 2. 使用一次性吸头，严禁与 PCR 产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免 气溶胶的污染； 3. 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心 溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面； 4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将 dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样 即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度； 5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管； 6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证 PCR 反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统 的可信性； 7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本 DNA 的污染， 最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少 PCR 操作过程中加样器应 该专用，不能交叉使用，尤其是 PCR 产物分析所用加样器不能拿到其它两个区； 8. 重复实验，验证结果，慎下结论。 二． 追踪污染源 如果不慎发生污