[生物学]4细胞基本培养技术.pptVIP

第四章  基本培养技术  第一节细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒 一、清洗 目的： 在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长 有害物质包括：微生物产品附带杂物 上次细胞残留物 非营养成分的化学物质 需要清洗的培养用品 玻璃器皿、胶塞、塑料制品 1、玻璃器皿的清洗 包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤 清洗后的玻璃器皿要求： 干净透明无油迹 不能残留任何物质 清洗：自来水洗，烘干 泡酸 自来水洗 去离子水洗 三蒸水洗 烘干 新瓶子均按该程序清洗，培养材料染菌的瓶子经高压灭菌后也按该程序清洗。 酸液（洗液）：浓硫酸+重铬酸钾 浸泡： 初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉。 刷洗： 用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。 刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度 浸酸： 玻璃器皿浸泡到清洁液中的过程 注意：浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。 浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时 配制、浸泡时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。  冲洗 在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹。 浸泡后的冲洗过程： 2、胶塞的清洗 新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理. 3、塑料制品的清洗 塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。 必要时用2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。 各种用品的包装 器皿的包装分为半包装和全包装 培养瓶 两个一组全包，包装前盖上螺旋盖子。 吸管 在与胶头相接端塞上棉花装入吸管筒。 青霉素小瓶 倒扣在饭盒中，全包。 滤器 上下口半包装再用报纸包，最后用布包好。 大的容器 如锥形瓶，加上棉塞后半包装。 枪头、EP管 装在相应的盒子中，全包。 手术器械 放在饭盒中，全包。 离心管 加盖子后全包 无菌germ free：没有活菌。 防腐antisepsis：应用理化方法防止和抑制微生物生长繁殖。 抑菌（bacteriostasis）：抑制体内或体外细菌生长繁殖。常用的抑菌剂为抗生素 1、消毒灭菌的方法 ★ 物理方法: 湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线。射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或去除微生物。 ★ 化学方法:使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。 2、消毒灭菌的注意事项 第二节 培养操作基本要领和要求 防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要努力做到最大限度的无菌。 一、培养前准备 1、制定出分门别类的操作卡片。 如“分装血清”、“组织块贴壁初代培养”、“传代培养”、等等。各卡片上记有需用器材和物品名称、要求及数量等，好处是实验者可按卡片收集所用物品，清点无误后，把用品放置于操作场地，然后进行消毒。 第三节 基本培养操作技术 一、传代培养法 当初代培养成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，进而扩展汇合，占满一切空间，此时需要进行分离培养。这一操作称传代或再培养。 80% 汇合或刚汇合细胞是理想传代阶段。 为什么要进行传代？ 1、贴壁细胞传代 2、悬浮细胞的传代培养 二、初代培养法 意义： 初代培养或原代培养，是从供体获取组织后的首次培养。其最大优点是：组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大的变化，具有二倍体遗传性状，在供体来源充分、生物条件稳定的情况下(年龄、性别)，在一定程度上能反映体内状态。 初代培养细胞是研究基因表达的理想系统。采用初代培养细胞做实验，如药物测试等效果也很好； 初代培养也是建立各种细胞系(株)必须经过的阶段。  1、原则： 幼体组织尤其是胚胎组织比年老个体的组织容易培养； 分化程度低的组织比分化程度高的容易生长； 肿瘤组织比正常组织容易培养。 一般在无特定要求时，取易培养的组织进行培养，成功率高。 （二）组织的分离 目的：为获取多量生长良好的细胞，必须把组织细胞分散开，使细胞解离出来；能达到单细胞水平更好，同时并不使细胞受伤害，细胞能很好生长。 分散组织的方法有离心法、机械法和化学法三种； 1．离心分离法 培养物为血液、羊水、腹水和胸水等细胞悬液时，可采用离心法分离。一般用低速500 ~ 1000 转／分速度，离心5 ~ 10 分钟即可。如悬液量大，离心时间可适当延长，但