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DNA重组技术的基本工具 培育抗虫棉的关键步骤： 关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来 关键步骤二：形成重组DNA 关键步骤三：重组DNA导入受体(棉花)细胞 一、 “分子手术刀” ——限制性核酸内切酶（简称限制酶） 1、来源：主要是从原核生物中分离纯化出来 2、种类：4000种 3、作用：识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 4、结果：形成两种末端：黏性末端和平末端 大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。 黏性末端 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 平末端 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？ 要切两个切口，产生四个黏性末端。 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。 二、基因的针线──DNA连接酶 DNA连接酶连接形成磷酸二酯键 DNA连接酶和DNA聚合酶的比较 比较 DNA连接酶 DNA聚合酶 不同点 连接DNA片段 （双链） 连接游离的脱氧核苷酸 （单链） 不需要模板 需要模板 相同点 连接不同脱氧核苷酸之间的磷酸和脱氧核糖 导入过程需要运输工具——运载体 运载体必须同时满足四个要求： ①能进入受体生物细胞并在受体生物细胞内复制并表达； ②具有多个限制酶切点，便于与目的基因结合； ③具有某些标记基因，便于筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等 ） ④对受体细胞无害，易分离 运载体的作用： 1、作为运载工具，将外源基因转移到受体细胞中去。 2、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。 常用的运载体：质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒等 质粒 质粒是基因工程最常用的运载体，它广泛地存在于细菌中，是细菌染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子，大小只有普通细菌拟核DNA的百分之一。 质粒能够“友好”地“借居”在宿主细胞中。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。但是，质粒的复制则只能在宿主细胞内完成。 基因工程的基本操作程序 基因的结构（原核细胞） RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。 非编码区：不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质 编码区：能够转录为相应的信使RNA，进而指导蛋白质的合成，也就是说能够编码蛋白质 真核细胞的基因结构 外显子: 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 内含子: 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使RNA 信使RNA前体 信使RNA 真核细胞的基因在转录时内含子和外显子是一起转录的，因而转录产生的mRNA必须经过加工，将内含子转录部分剪切掉，将外显子部分拼接起来，才能成为有功能的成熟的mRNA。原核生物的基因由于不含有外显子和内含子，因此，转录产生的mRNA不需要剪切、拼接等加工过程。 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是连续的 编码区是间隔的、不连续的 相同点 都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的 基因工程操作的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 目的基因的制备 ? 目的基因就是所需要克隆的外源基因 （主要指编码蛋白质的结构基因） ? 制备方法： 1、人工合成法 2、逆转录法 3、用限制性内切酶直接从染色体DNA中离 4、用PCR法扩增目的基因片段 5、从基因文库中获取 目的基因的制备：人工合成法 ? 较小分子基因可用人工化学合成的方法获得 ? 人工合成目的基因的先决条件是基因的核苷酸序列是已知的 ? 缺点是：1、不能合成太大的基因；2、合成基因时遗传密码的兼并现象会为选择密码带来很大困难；3、费用较高 目的基因的制备：逆转录法 ? 若所需基因较大，人工合成有困难，从组织中分离提取也不容易，则可利用逆转录法合成。 ? 该法是：以编码某特异多肽的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下反转录成该多肽mRNA的互补DNA（cDNA）；再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA。 可用于真核生物目的基