植物组织中冠瘦碱合成酶活性检测的试验技术与方法一-遗传.PDF

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植物组织中冠瘦碱合成酶活性检测的试验技术与方法一-遗传

遗传 HEREDITAS(Beijing)9(5):41-431982 礴 爪 ~ 勺 爪 木 爪 实 木 爪 爪 验 爪 植物组织中冠瘦碱合成酶活性检测的 爪 爪 木 爪 爪 技 爪 爪 爪 爪 爪 爪 术 木 爪 爪 一种简便有效方法 余 爪 与 爪 爪 木 爪 方 爪 爪 爪 许 耀 贾敬芬 郑国锡 梅 木 木 法 W 沙 宙 兰(州大学生物系) 一 由根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens) 2.正常的向日葵愈伤组织。 感染引起的植物冠4瘤 (crowngall)细胞除 二()试剂与设备 具激素自养性生长特性外,还具有一类特殊的 1.试剂 精氨酸,章鱼碱,胭脂碱,a-酮 基因产物,即冠瘦碱 (opines)。常见的冠瘦碱 戊二酸,丙酮酸钠,乙醇,乙酸,甲酸,菲酮, 主要有章鱼碱 (octopine)和胭脂碱 (nopaline) NaOH,甲基绿,MS培养基2,『成份。 等。催化章鱼碱合成的酶为章鱼碱合成酶(oct- 2.设备 电泳仪,平板电泳槽,离心机, opinesynthase),或叫Lysopine脱氢酶 [D- 电吹风,微量进样器,紫外检测灯,Whatman (+)一lysopinedehydrogenase,简称 LpDH]o 3或1号层析纸或新新3号滤纸。 催化胭脂碱合成的酶为胭脂碱合成酶(nopaline (三)操作程序 synthase),或称胭脂碱脱氢酶 (nopalinedehyd- 1.预培养 将待测组织切成小块,转人 rogenase,简称 NpDH)。即在NADH存在条 含 1omm 精氨酸-I-5mMa-酮戊二酸 (用于胭 件下,LpDH催化丙酮酸与精氨酸的缩合反应, 脂碱型冠廖瘤组织中NpDH活性的检测)或 形成章鱼碱;NpDH催化。一酮戊二酸和精氨酸 lOmm精氨酸+5mM丙酮酸钠 用(于章鱼碱型 的缩合反应,形成胭脂碱。 冠廖瘤组织中LpDH活性的检测)的MS培养 冠瘦碱的合成是由于根癌农杆菌 Ti质粒 基上。 在一般培养条件下保温培养24小时以 的T-DNA 转(移DNA)在植物细胞中发生了 上。 转移、整合与表达的结果。因此,植物细胞中冠 2.冠瘦碱的提取 取经预培养的待测组 瘤碱合成酶活性的存在常被用作T-DNA转化 织于小研淋中。加人等体积的80关乙醇。研 与否的一个主要证据。近年来,研究者们基本 磨后,将匀浆液转人具盖的离心管中。于室温 都采用 Otten等的方法a〔来检测植物细胞中冠 下浸提 1小时以上。离心后弃去沉淀。 瘦碱合成酶的活性。我们对此法进行了一些改 3.点样 用微量进样器取浸提的上清液 进,即在活体状态下来检测冠瘤碱合成酶活性 3微升左右在层析纸上点样。以胭脂碱、章鱼 的存在。现以向日葵冠瘦瘤组织及其正常愈伤 碱或胭脂碱+章鱼碱+精氨酸 (各0.1毫克/毫 组织为例作一介绍。 升)为标准样品。 4.纸电泳 电泳液为乙酸 :甲酸 :水二 材 料 与 方 法 12:15:63。以0.5外甲基绿乙醇溶液为电泳指 一()材料 1.根癌农杆菌章鱼碱型菌株 B6S3和胭脂 XuYaoetal.:ASimpleandEfficientMethod for theDete

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