植病研究技术---分子生物学演示幻灯片.pptVIP

一. DNA/RNA/蛋白质的提纯 ---基因工程 感受态细胞（competent cell）：理化方法诱导细胞， 使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。 CaCl2法： 　 将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞 细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶 的羟基－磷酸钙复合物。 此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。   一. DNA/RNA/蛋白质的提纯 ---基因工程 质粒提取 （碱裂解法） 离心集菌 溶液 Ⅰ悬浮 溶液 Ⅱ碱裂解 溶液 Ⅲ 中和 酚仿抽提 乙醇沉淀 质粒定性/定量 质粒提取试剂盒 一. DNA/RNA/蛋白质的提纯 ---基因工程 质粒定量/定性 分光光度计 VS 一. DNA/RNA/蛋白质的提纯 ---基因工程 限制性内切酶   限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。 发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。 每种限制酶能识别和切割的通常为4～8个核苷酸序列，称为限制性位点或切点。 一. DNA/RNA/蛋白质的提纯 ---基因工程 限制性内切酶   命名 ：来源+次序 切割模式：平端 或 粘性末端 同裂酶/同尾酶 一. DNA/RNA/蛋白质的提纯 ---基因工程 限制性内切酶   质粒 /片段/全基因组 ？ul 10x buffer 1/10总体积 限制性内切酶 ？ul ddH2O 总体积 反应温度 ？，反应时间？ 限制性内切酶的活力单位（U）：1U的酶指1小时可酶切1ugDNA 反应体系： 反应条件： 星活性又称Star活性。是指由于反应条件不同而产生的切断与原来认识序列不同的位点的现象，也就是说产生Star活性后，不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。 一. DNA/RNA/蛋白质的提纯 ---基因工程 3. 修饰酶：  连接酶：催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末 端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子。 DNA聚合酶： DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具 备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。 磷酸酶：通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去， 并生成磷酸根离子和自由的羟基。----去磷酸化 激酶： 催化ATP上的5′-磷酸基团转移到其他化合物上的酶---磷酸化 反（逆）转录酶：以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互 补DNA（cDNA）的酶 各种核酸酶：催化核酸酯键的水解 一. DNA/RNA/蛋白质的提纯 ---基因工程 4. 聚合酶链式反应 (PCR): 生物体外的特殊DNA复制 双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝.但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵. 耐热DNA聚合酶--Taq酶 一. DNA