[农学]2011生物培训-生物化学部分.ppt

生物化学基础实验及其所涉及的问题讨论 第一部分:糖的定性和定量 糖的种类及其结构特点 不同种类的糖如何定量(针对性) 糖类定量的特点 可溶与不可溶糖 还原糖与非还原糖 多糖与低聚糖\单糖 总糖定量 还原糖定量 食品国标定糖法 总糖 可溶性总糖蒽酮法 原理： 糖类在较高温度下可被浓硫酸作用而脱水生成糠醛或羟甲基糖醛后，与蒽酮(C14H10O)脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色。该物质在620 nm处有最大吸收，在150 μg/mL范围内，其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。 这一方法有很高的灵敏度，糖含量在30 μg左右就能进行测定，所以可做为微量测糖之用。一般样品少的情况下，采用这一方法比较适合。 试剂： (1)葡萄糖标准液：l00 μg/mL (2)浓硫酸 (3)蒽酮试剂：0.2 g蒽酮溶于100 mL浓 H2SO4中。当日配制使用。 2.植物样品中可溶性糖的提取： 将样品粉碎，105 oC烘干至恒重，精确称取1~5 g，置于50mL三角瓶中，加沸水25mL，加盖，超声提取10 min，冷却后过滤（抽滤），残渣用沸蒸馏水反复洗涤并过滤（抽滤），滤液收集在50mL容量瓶中，定容至刻度，得可溶性糖的提取液。 3.稀释： 测定： 吸取提取液2mL，置于另一50mL容量瓶中，以蒸馏水定容，摇匀。 吸取1 mL已稀释的提取液于试管中，加入4.0 mL蒽酮试剂，平行三份；空白管以等量蒸馏水替代提取液。以下操作同标准曲线制作。根据A620平均值在标准曲线上查出葡萄糖的含量（μg）。 五、计算： C × V总 × D 样品含糖量（%）= ─────── × 100% W × V测 × 106 其中： C——在标准曲线上查出的糖含量（μg）， V总——提取液总体积（mL）， V测——测定时取用体积（mL）， D——稀释倍数， W——样品重量（g）， 106——样品重量单位由g换算成μg的倍数 注意事项： 该显色反应非常灵敏，溶液中切勿混入纸屑及尘埃。 H 2SO4要用高纯度的。 不同糖类与蒽酮的显色有差异，稳定性也不同。加热、比色时间应严格掌握。 还原糖 1. 菲林滴淀法 原理 将一定量的碱性酒石酸铜甲、乙液等量混合，立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀，这种沉淀很快与酒石酸钾钠反应，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物。在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化亚铜沉淀，待二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖把次甲基蓝还原，溶液由蓝色变为无色，即为滴定终点。 试剂 ① 碱性酒石酸铜甲液：称取15g硫酸铜 及0.05g四甲基蓝，溶于水中并稀释到1000 ml ② 碱性酒石酸铜乙液:取50g酒石酸钾钠及75g氢氧化钠，溶于水中，加4g亚铁氰化钾，完全溶解后，再用水稀到1000 ml，储存于橡胶塞玻璃瓶内。 ③ 乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌，加3 ml冰醋酸 ，加水溶解并稀释1000 ml。 ④ 106g/L亚铁氰化钾溶液。 ⑤ 盐酸。 ⑥ 葡萄糖标准液：准确称取1.000 g干燥至恒量的 纯葡萄糖，加水溶解后加入5 ml 盐酸，并以水稀释至1000 ml此溶液酶1 ml相当于1 mg葡萄糖。 ① 样品处理 取适量样品，按前述的原则对样品进行提取，提取液移入250 ml容量瓶中，慢慢加入5 ml乙酸锌的溶液和5ml亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，摇匀后静至30分钟。用干燥滤纸过滤，弃初滤液，收集滤液备用。 碱性酒石酸铜溶液的标定 准确吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各5ml，置于250ml锥形瓶中，加水10ml，加玻璃珠3粒。 从滴定管滴加约9ml葡萄糖标准溶液，加热使其在2分钟内沸腾，准确沸腾30秒钟，趁热以每2秒一滴的速度滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。 ③ 样品溶液预测 吸取碱性酒石酸铜甲液及乙液各 5 ml，置于250ml锥形瓶中，加水10ml，加玻璃珠3粒。加热使其在2分钟内沸腾，准确沸腾30秒钟，趁沸以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品液，须始终保持溶液的沸腾状态，待溶液蓝色变浅时，趁热以每2秒一滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录消耗溶液的体积。 ④ 样品溶液测定 吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各5ml，置于250ml锥形瓶中，加水10ml，加玻璃珠3粒。从滴定管加入比预测时样品溶液消耗总体积少1ml的样品液，使其在2分钟内加热至沸，准确沸腾30秒钟，趁热以每2秒一滴的速度继续滴定，直至蓝色刚好褪去为终点。记录消耗样品液的体积。平均做操作3次，取其平均值 结果计算 还原