基因组dna的杂交专题之二基因组dna的酶切dna分子杂交.pptVIP

杂交后非放射性标记探针的检测 酶联单抗或多抗—比色、产荧光、化学发光 比色：碱性磷酸酶 荧光检测：碱性磷酸酶 化学发光： 辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶 * 基因组DNA的杂交专题之二 基因组DNA的酶切 DNA分子杂交，双链DNA分子的变性并和带有互补序 列的同源单链间的配对过程 重组体筛选 基因筛选 DNA同源性检测 基因定位 物理图谱 Southern 杂交 用途 基因组DNA 转移缓冲液 DNA限制片段 琼脂糖凝胶电泳 与标记探针杂交 检测 盖子 两层长滤纸 三层湿滤纸 凝胶 n+ 尼龙膜 三层湿滤纸 十层干滤纸 10cm吸水纸 转 膜 限制性酶切 Southern流程示意 在灭菌的1.5mL管中，按下表准备酶切反应体系 37℃保温至少3小时 加入1／10体积的3mol/L NaAc pH5.2和2倍体积的无水乙醇 室温沉淀20分钟 12，000r/min 离心10分钟，弃上清。 室温干燥 加入10uL TE溶解 8uL 10uL 32uL 基因组 DNA 50uL HindIII 10 x buffer K H2O 核酸 100uL酶切体系 基因组DNA的酶切 1、非放射性标记 生物素（bio-11-dUTP或bio-7-dUTP）（哺乳动物中普遍存在，背景高） 地高辛（DIG，洋地黄类植物专一合成的复合物，DIG-11dUTP) 荧光素（用的不普遍） 随机寡核苷酸引物法、PCR、切口平移、末端转移等酶学方法都可标记探针 2、放射性标记---- 同位素标记 一、核酸探针的标记 二、核酸探针的检测 DIG－dUTP 探针 连接臂 DIG 浓紫色沉淀（二甲臢） 浓紫色沉淀 （二溴二氯靛蓝） 比 色 法 靶序列 Ab1 AP BCI BCIP 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐 NBT（氮蓝四唑） 氧化 还原 轻洗 荧 光 法 Ab1 靶序列 探针 连接臂 DIG AP AP HNPP 2-羟-3-奈酸-2’-苯基胺磷酸 HNP(荧光沉淀） 可用290nm紫外激发 三、实验操作 0.7%琼脂糖凝胶25mL(1×TAE),含1uL GoldViewTM 加样 DNA标准 8uL 含AKP质粒1uL 酶切产物 ＋ 1uL 10×loading buffer 基因组DNA 4.5uL ＋ 0.5uL 10×loading buffer 电泳： 恒压80V电泳 当溴酚蓝染料移出凝胶前沿10min后，停止电泳 凝胶成像仪观察和记录电泳结果 1、酶切产物的琼脂糖凝胶电泳 2、Southern转膜 （注： 操作要戴上一次性手套） 预先裁剪： 尼龙膜一张（比凝胶大一毫米） 滤纸六张（膜一样大小） 滤纸二张（与膜同宽，长20cm） 纸巾一叠（共10cm厚)，大小均一 纸巾与胶大小相同 滤纸十张，与胶同样大小 切掉无样品的凝胶区域，并剪掉一角以标记点样顺序，然后转至玻璃平皿中 ? 在室温下将凝胶浸泡在变性溶液中15分钟，并轻轻摇动 ? 更换变性液继续浸泡凝胶20分钟，并轻轻摇动 2、Southern转膜 尼龙膜相应剪掉一个角，六张与膜一样大小的滤纸， 先用重蒸水浸湿 ? 再放入变性液中浸泡约30min （注： 操作要戴上一次性手套） 在玻璃板上先放上约10cm高的纸巾上，并在其上放上10层同样大小的干滤纸 将夹心饼结构放到其上 在其上放两层浸湿转移缓冲液的滤纸（滤纸的两端浸入转移缓冲液中） ? 盖上盖子，让凝胶上的DNA下行转移16小时或过夜 ? 将尼龙膜与凝胶剥离，将膜浸在中和缓冲液中，室温15分钟，并轻轻摇动 ? 更换中和缓冲液继续室温浸泡15分钟，并轻轻摇动 制作夹心饼式的结构（由下至上):三张潮湿的滤纸\膜\凝胶\三张潮湿的滤纸（胶与膜的切角对齐,千万不要有气泡） 预杂交： 将膜放入杂交管中，加入预杂交液，在65℃杂交炉中预杂交过夜 ?（4℃保存一周） 杂交：将含膜的杂交管从4℃转入杂交炉中，待杂交液变清后取出，打开盖子，将预杂交液倒出 ? 小心取出膜，转入装有5ml杂交液（含有探针的新鲜预杂交液）的袋子中，尽量将袋中的空气全部挤出 ? 热封机封口，轻轻挤压袋子以检查密封的强度是否完整? 将袋子放在62℃恒温水浴中杂交16小时或过夜 3、Southern杂交 （注： 操作要戴上一次性手套） 方向，标记 探针变性：100℃加热5min 迅速放入冰水浴中冷确 ? 洗膜：一洗：2