[医药卫生]THE BASIS OF REAL TIME PCR.ppt

;提 要;欧比特仪器有限公司是ABI在中国内地的唯一授权经销商;AB —三大Nobel 获奖技术的拥有者 ！！！ ;荧光定量PCR原理;;PCR动力学曲线和四个阶段;如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析 一个方程： PCR理论方程 两个概念： 荧光阈值、Ct值 ;lg [DNA];什么是荧光阈值？;什么是CT值？;定量PCR的化学原理;两种化学;SYBR?Green I 染料法; SYBR Green I 染料发光特性;Denaturation;数量关系;染料法的局限性及ABI提供的解决方案;熔解曲线(Dissociation curve);特异PCR的融解曲线;非特异PCR的融解曲线;染料法的局限性及AB提供的解决方案;PowerSYBR? Green PCR Master Mix AmpliTaq Gold LD polymerase;染料法的局限性及ABI提供的解决方案;TaqMan序列特异探针法;TaqMan探针法;;;;No fluorescent signal (emission) from reporter;荧光共振能量转移(FRET);Light energy;TaqMan? in action . . .;;;Taq comes in . . .;;;;;;Taq is special . . .;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;TaqMan 探针法之数量关系;TaqMan探针法定量的特点;AB解决方案——TaqMan? Gene Expression Assays;AB解决方案——TaqMan? Arrays;384-Well TaqMan? Gene Signature Array; TaqMan? Gene Expression Master Mix ;荧光定量PCR数据分析;荧光定量PCR的定量方法;CT值 ? [DNA]0 ;绝对定量（绝对标准曲线法）;绝对定量：绝对标准曲线法;绝对定量——实验设计;荧光定量PCR的定量方法;相对标准曲线法：目的基因和管家基因都要做标准曲线; 相对标准曲线法数据分析;相对标准曲线法——实验设计; Nn = N0 (1+E)n NCT = N0 (1+E)CT 当E = 100% = 1时，1+E = 2 NCT = N0 2CT N0 = NCT 2 -CT 所以， N01/N02 = NCT1/NCT2 2 –(CT1– CT2) = 2 – ΔCT （ 1，2代表两组实验对象） 用内参进行校正 (N01/N01内）/ (N02/N02内）= (2 – ΔCT1) / (2 – ΔCT2) =2 –(ΔCT1– ΔCT2) = 2 –ΔΔCT2 ;假设目的基因与管家基因扩增效率相同且为100%，数学推导得出 目的基因的相对含量=2-ΔΔCt 即实验组目的基因的表达量相对于对照组的变化倍数 ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照;比较Ct值法分析（不同处理时间）;比较Ct值法分析（不同类型组织）;ABI Prism SDS Software -RQ Study;适宜：多基因、大样本，低差异 每个样本必须同时做目的基因和管家基因 ---需要验证目的基因和管家基因的扩增效率是否相同且为100％ ΔE (between target and reference gene) = 0.03, the difference in expression ratio is 46% (Etarget Eref) and 209% (Etarget Eref) ΔE = 0.05, 27% and 338% ΔE = 0.10, 7.2% and 1083% (Pfaffl et al., 2002) ---PCR扩增片段长度150bp 优点：不需要做标准品；应用广泛 困难：需要大量前期的优化工作 所有ABI TaqMan? Gene Expression Assays的扩增效率均为100％，无须条件优化及扩增效率的验证。;定量PCR的应用;ABI荧光定量PCR技术的应用;SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) 单一碱基序列多态性;概述;SNP研究意义;;TaqMan?MGB探针SNP分型原理;C;FAM纯合子;探针？？？;两种探针效果比较;AB解决方案——MGB探针;2 条引物+2条TaqMan?MGB探针(VI