生物化学实验报告精选 .doc

生物化学实验报告 姓 名：学 号：实验时间：实验分组：组内成员： 任课教师：实验报告 XXXX 2012年11月17日 摘要 本实验通过从小牛肠中通过刮去，离心，析出等方式提取小牛肠碱性磷酸酶，再通过SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量，利用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量及测定酶的活性。 1. 实验部分 试剂与仪器 1.试剂： 正丁醇、丙酮。 1 mol/L 醋酸，1 mol/L NaOH，硫酸铵。 平衡缓冲液： mol/L Tris-HCl，pH 。 底物缓冲液：1 mol/L 二乙醇胺-盐酸缓冲液。 酶的底物溶液：用底物缓冲液配制15×10-3 mol/L 对硝基苯磷酸二钠溶液。 30% 丙烯酰胺置棕色瓶。 分离胶缓冲液： mol/L Tris-HCl缓冲液，pH ，已加入10% SDS。 浓缩胶缓冲液： mol/L Tris-HCl缓冲液，pH ，已加入10% SDS。 10% 过硫酸铵。 TEMED。 上样缓冲液：称100 mg SDS、2 mg溴酚蓝、2 g甘油，加 mL巯基乙醇、2 mL /L pH Tris-HCl，加超纯水定容至10 mL。 染色液：配置含% 考马斯亮蓝R250，40%甲醇和10%冰醋酸的染色液500 mL，过滤后备用。 脱色液：500 mL 10%甲醇和10%冰醋酸的脱色液1000 mL。 电泳缓冲液。 2.仪器 匀浆机、eppebdorf5型冷冻离心机、GSY—2型恒温水浴、UV762型紫外可见分光光度计。离心管，剪刀，载玻片，不锈钢盘，搪瓷盘，滤布，漏斗，分液漏斗，量筒，烧杯，移液抢，比色皿，DYY—11型电泳仪，24D型电泳槽，制胶板，揺床，移液枪。 小牛肠碱性磷酸酶提取方法 1）取新鲜小牛肠，用剪刀剖开，用载玻片刮取小肠内粘膜，放到盘子一角。 2）将小肠粘膜液集中倒入匀浆机中，加冰冷蒸馏水，高速匀浆，重复多次。 3）缓慢加入冰冷正丁醇高速匀浆重复多次。在4℃，10000 rpm条件下离心。 4）用滤布过滤去除杂质，倒入分液漏斗中，静止分层，取下层水相，用HAc溶液调pH到。4℃，10000 rpm，离心。 5）得到上清后放入离心管中，用NaOH溶液调pH至，称取硫酸铵加到离心管中溶解；再加冰冷丙酮，混匀，4℃静置30 min以上。4℃，10000 rpm，离心。 6）上清液中加入冰冷丙酮，4℃放置30 min以上。4℃，10000 rpm，离心。 7）取沉淀溶于平衡缓冲液至全部溶解至冰箱保存待用。 8）底物处理：底物37℃水浴5 min。 小牛肠碱性磷酸酶酶活检测方法 1）将酶稀释10倍。 2）紫外分光光度计检测条件为405 nm波长，测定时间60 s，取值2 s，记录范围。3）取2个2 mL比色皿，加入上述加热的底物缓冲液，校对归零。 4）将稀释10倍的酶液加到其中1个比色皿中，用手堵住皿口。快速 上下倒2次，放回分光光度计中，测定酶动力学曲线 聚丙烯凝胶制备 1）装板：将垂直板型电泳的玻璃片洗净、晾干；放好胶条，用夹子夹好玻璃板，上面插上梳子，垂直放置在水平台面上备用。 2）制备分离胶：在小烧杯中按下表配制所需浓度的分离胶。 分离胶制备 试剂 用量 H2O 30% 丙烯酰胺 mol/L Tris-HCl缓冲液pH 10% 过硫酸铵 TEMED 3）制备浓缩胶：在小烧杯中按下表配制所需浓度的浓缩胶。 mL mL mL 100 μL 10 μL 浓缩胶制备 试剂 H2O 30% 丙烯酰胺 mol/L Tris-HCl缓冲液pH 10% 过硫酸铵 TEMED 4）蛋白样品处理：在 mL离心管中按1：1体积比例，加样品和上样缓冲液，100?C加热使蛋白变性。 5）浓缩胶完全聚合后，去掉夹子和胶条，拔去梳子，将凝胶玻璃板固定于电泳装置内槽上，加入电泳缓冲液，缓冲液高过玻璃板凹面。 用量 mL mL mL 60 μL 8 μL 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 1）玻璃试管中加入考马斯亮蓝。 2）在 mL离心管中，取酶液分别稀释50、100、200倍。 3）各取100 μL加入到5 mL考马斯亮蓝试管中，混匀，反应5 min以上。 4）紫外分光光度计检测条件：595 nm 波长。 5）取2个比色皿，加入考马斯亮蓝，分光光度计中校对归零。 6）将样品放入外侧比色皿中，读吸光值