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为了提高定性分析的可靠性，还可进一步改变色谱条件（分离柱、流动相、柱温等）或在样品中添加标准物质，如果被测物的保留时间仍然与标准物质一致，则可认为它们为同一物质。 2. 保留指数定性 保留指数 本章要求 高效液相色谱法 一、高效液相色谱法的特点 二、流程及主要部件 三、固定相和流动相 四、主要分离类型 五、影响分离的因素 （一）分配色谱 （二）吸附色谱 （三）离子交换色谱法 （四）排阻色谱法 分配色谱 分配色谱–分离原理 固定相的化学构造 非键合相表面 键合相表面 ODC C18 C8 C1 Phenyl -NH2 -CN 吸附色谱法 分离原理 排阻色谱法(凝胶色谱法) 大分子不能进入多孔中，不被保留，随 Vm流出 中分子部分进入多孔中，一般保留 小分子完全进入多孔中，长时间保留。 高分子化合物分子量及分子量分布 DNA碎片不同碱基支链分离。 流动液贮存提供脱气 输液泵 进样系统 分离系统 检测系统 控制与记录系统 进样系统 不使整个压力变化的情况下将样品注入色谱柱，通常使用所谓六通阀 （1）真空泵抽滤系统 （2）低溶性惰性气体导入替换 （3）超声脱气 （4）在线脱气 活塞泵 注射泵 气动泵 单波长UV检测器，光源用Hg灯，加滤光片可以到254，280，313，334，365等。生化中用到很多。 多波长 光度计类似，光栅或棱镜分光 标准样品法 谱库 HPLC-FTIR HPLC-MS 高效液相色谱法的类型 液液分配色谱(LLPC) 键合固定相分配色谱(LSPC) 分配色谱法 (Partition Chromatography) 液体固定相通过物理吸附固定于载体表面 有机分子通过化学反应键合到载体表面 不同组分在两相间分配系数不同 固定相 --- 物理吸附 （担体 + 固定液） 全多孔型担体 薄壳型微珠担体 分配色谱固定相 固定相 --- 化学键合 R --- 极性基团 疏水基团 离子交换基团 极性大先出 极性小先出 出峰顺序 极性 非极性 流动相性质 疏水基团 极性基团 键合基团 非极性 极性 固定相性质 反相分配色谱 正相分配色谱 正相HPLC（normal phase HPLC）： 是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC。 反相HPLC（reversed phase HPLC）： 由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。 ODS（Octa Decyltrichloro Silane) 溶质与流动相分子在吸附剂表面上的吸附竞争 吸附色谱固定相 以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。 离子交换色谱 固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。 各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。 分离原理 固定相 分离对象 离子或可离解的化合物 （无机离子、氨基酸、蛋白质等） 分离原理 根据样品分子尺寸大小分离 1. 软凝胶：铰链葡萄糖的多孔聚合物，聚丙烯酰胺凝胶。（凝胶过滤色谱） 2. 半硬凝胶：聚苯乙烯珠（凝胶渗透色谱） 高硬凝胶和玻璃：多孔玻璃或多孔硅球，经化学键合处理，不随压力及溶剂改变尺寸，（高效排阻色 谱） 排阻色谱固定相 应用 高效液相色谱仪 日本岛津公司 美国Waters公司 流动相脱气方法 输液系统 高压输液泵： 高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。 输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。 色谱柱 色谱柱 泵 泵 1 2 进样 不使整个压力变化的情况下将样品注入色谱柱，通常使用所谓六通阀 进样系统 色谱柱 色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。 检测器 用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。 紫外-可见检测器 荧光检测器 电化学检测器 蒸发光散射检测器 质谱检测器 A＝lg（I0/It)= εb c 紫外-可见检测器 荧光检测器 许多有机化合物，特别是芳香族化合物、被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。但可以与发荧光物质反应衍生化后检测。 ? 特点： 有非常高的灵敏度和良好的选择性，