[理学]第二章 基因工程的载体和工具酶.pptVIP

* 经同尾酶消化的DNA末端连接示意图 5’ XXXXGGATCCXXXXXX 3’ 3’ XXXXCCTAGGXXXXXX 5’ BamH I 5’ XXXXG GATCCXXXXXX 3’ 3’ XXXXCCTAG GXXXXXX 5’ 5’ XXXXAGATCTXXXXXX 3’ 3’ XXXXTCTAGAXXXXXX 5’ Bgl II 5’ XXXXA GATCTXXXXXX 3’ 3’ XXXXTCTAG AXXXXXX 5’ 5’ XXXXA GATCCXXXXXX 3’ 3’ XXXXTCTAG GXXXXXX 5’ 5’ XXXXAGATCCXXXXXX 3’ 3’ XXXXTCTAGGXXXXXX 5’ BamH I Bgl II 一个限制酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃）下，1h内中完全降解1 ?g ? DNA所需要的酶量。 影响酶切反应的因素很多，最重要的有： ⑴　DNA的纯度、浓度（不超过1.5ug/50ul) ⑵　 DNA的甲基化程度（大肠杆菌中含有Dam和Dcm甲基化 酶）MboI 不能酶切甲基化序列，但同功酶Sau3AI可以 ⑶　酶切反应的温度（通常为37℃ ） ⑷　DNA的分子结构 ⑸　 核酸内切限制酶的缓冲液 （10X母液） （6）反应时间 通常为1.5小时 （7）加入酶量 不超过总体积的10% （五）限制性核酸内切酶的消化反应 在“非最适的”反应条件下,有些核酸内切限制酶识别序列 的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的 其它位点切割DNA分子，这种现象叫星号活性。用*表示。 酶切失败的原因及解决： 1）没有完全酶切甚至DNA基本没有被酶切： 缓冲体系不合适， 建议重新酶切； 酶量过多， 建议稀释； DNA样品杂质过多， 建议重新抽提 2）DNA被降解（不成带状）： 主要原因是DNA样品中含有痕量的DNA酶，需重新抽提去除DNA酶 * 酶 切 反 应 的 基 本 步 骤 ＋ － 电泳 紫外分析 37℃ 1h 加反应液 CK M ddH2O 约16.5 ?L Buffer (10X) 2.0 ?L DNA 0.2~1.0 ?g Enzyme 1～2U Volume 20.0 ?L 1.0kb 1.0kb 0.4kb 0.5kb 0.6kb CK M T T * （一）DNA连接酶的发现 （二） DNA连接酶作用特点 （三） DNA连接酶的反应条件 （四）DNA连接的策略 二、 DNA连接酶及其应用 * （一）DNA连接酶的发现 环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种 切口的酶存在。 首个DNA连接酶(ligase)——1967年，大肠杆菌DNA连接酶，是大肠杆菌基因编码 。 1970年，发现了T4DNA连接酶 ， 由大肠杆菌T4噬菌体基因编码的。 * （二）DNA连接酶作用的特点 A. 连接的两条链必须分别具有自由3’－OH和 5’－P，而且这两个基团彼此相邻； B. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。 E.coli DNA连接酶 －连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），现在研究可连接平末端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。 T4 DNA连接酶－连接具互补碱基黏性末端和平末端， 需ATP辅助因子，活性高，常用。 * 是两条链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。 OH P × × 是相邻的－因此不能封闭gap，只能封闭nick. gap NO Nick OK * DNA 连接酶连接的作用机制 ⑴ E(酶)＋ATP→E－AMP＋ppi E(酶)＋NAD→E－AMP＋NMN ⑵ E－AMP ＋DNA＝DNA－AMP＋E ⑶ DNA上的3’－OH对被活化的磷原子进行亲核攻击，形成磷酸二酯键，同时释放出AMP。 * （三）T4DNA连接酶连接反应的条件 影响连接效率的因素有： A. 温度（通常在4-15℃ ） B. ATP的浓度(10μM／L - 1?M／L ) C. 连接酶浓度（一般平末端大约需1～2U，黏性末端仅需0.1U） D. 反应时间（通常连接过夜） E. 插入片段和载体片段的摩尔比（ 1∶1～5