[生物学]第五节 亲和层析.pptVIP

第八章 色谱分离技术 第五节 亲和色谱分离技术 亲和色谱分离技术 (affinity chromatography,AFC,简称亲和层析法) 是专门用于生物大分子的色谱分离技术，它是一种基于生物活性物质之间的可逆、具有专一性作用的分离技术。即是基于固定相的配基与生物分子间的特殊生物亲和能力来进行相互分离的。它也属于一种吸附色谱分离法。 早在 1910 年就有人用不溶性淀粉选择吸附、提纯淀粉酶，这是最早的基于生物特异性进行分离纯化的实例。事实上几乎所有的生物活性物质都存在类似于淀粉酶与淀粉间的亲和作用，如酶与底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅助因子）、抗原与抗体、激素与受体、核酸中的互补链、多糖与蛋白复合体等。这种利用生物大分子特异亲和力而设计的层析技术称为亲和层析（密切关系套色版）。在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基，与配基结合的层析介质称为载体。 一、原理 亲和层析的设计原理和过程大致分为以下三步： （1）配基固定化：选择合适的配基与不溶性的支撑载体偶联或共价结合具有特异亲和性的分离介质。 （2）吸附样品：亲和层析介质选择性吸附酶或其它生物活性物质，杂质与层析介质间没有亲和作用，故不能被吸附而被洗涤除去。 （3）样品解吸：选择适宜的条件使吸附的亲和介质上的酶或其它生物活性物质解吸下柱。 二、亲和层析的特点 亲和层析技术的最大优点在于，利用它从粗提液中经过一次简单的处理便可得到所需的高纯度活性物质。例如胰岛素受体，该受体经过一步处理就被纯化了 8000 倍。这种技术不但能用来分离一些在生物材料中含量极微的物质，而且可以分离那些性质十分相似的生物物质。 此外,亲和层析法还有对设备要求不高、操作简便、适用范围广、特异性强、分离速度快、分离效果好、分离条件温和等优点；其主要缺点是亲和吸附剂通用性较差，故要分离一种物质差不多都得重新制备专用的吸附剂。另外,由于洗脱条件较苛刻，须很好地控制洗脱条件，以避免生物活性物质的变性失活。 三、亲和吸附剂的制备 亲和吸附剂的制备包括三步： 1、载体的选择 2、配基的选择 3、载体的活化与偶联 （一）载体的选择 1、亲和层析对载体的要求 载体在亲和层析中的作用是使配基固定化，同时提供了亲和对两物质特异性结合的空间环境。配基与亲和配体的结合势必受到载体的影响。 （1）载体必须能充分功能化，也就是说载体要具有足够数量的功能基团，或能方便地引入多量的化学活性基团，以使与配基进行共价连接之用。 （2）载体必须有较好的理化稳定性和生物惰性，尽量减少非专一吸附。这样的载体就能耐受亲和、洗涤、洗脱等各种条件下的处理而不改变其膨胀度、网孔结构和硬度等性质。此外，载体还应不易为酶破坏，也不能为微生物所利用。这样可使亲和固定相便于使用和保存。 （3）载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。载体的亲水性往往是保证被吸附生物分子稳定性的重要因素之一。同时，亲水性还有助于达到亲和平衡，并减少因疏水力造成的非特异性吸附。 （ 4 ）载体应具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过。高度的多孔性对大分子自由流动是必需的，同时也为提高配基及配体的亲和有效浓度提供了条件，使之接近溶液中的状态，这种状态十分有利于亲和对的两种成份在自由溶液中发生的相互作用。 （ 5 ）理想的亲和层析载体外观上应为大小均匀的刚性小球，这样在层析柱中才能保持良好的流速。通常，精细载体小珠的分离作用能极大地促进扩散速率低的生物大分子达到扩散平衡，由细小的凝胶颗粒填充的亲和层析过程，流速虽慢些，但分离效果良好。 2、常用载体 （1）纤维素 它是自然界中数量最大的大分子生物材料，取材十分方便。但由于纤维素结构紧密，均一性差，不利于大分子的渗入。活化后因带有电荷，非特异性吸附力较强，加上空间位阻等原因，其应用不如凝胶载体广泛。目前主要用于分离与核酸有关的物质，如用寡聚脱氧胸腺核苷酸纤维作固定相分离细胞提取液中的 mRNA 。 市售纤维素商品为无定形微纤维、微晶纤维素以及珠状纤维素。 （2）琼脂糖凝胶 它是由 D-半乳糖和 3、6-脱水-L-半乳糖相结合的链状多糖，商品名为Sepharose。用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。其琼脂糖浓度有2%、4%、6%几种，相应的商品称为 Sepharose 2B,4B 和 6B(Pharmacia) 和 Utrogels 一 -2 ，一 -4 ，一 -6 （ LKB ）。这类载体能使吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松孔径大，流速快。例如， Sepharose 4B 的分子量排阻极限达上百万，便于大分子通过；载体几乎没有带电基团，非专一性吸附少。 Sepharose CL 是用二溴丙烷处理的交联琼脂糖，它的稳定性明显增加