[生物学]重组基因导入受体细胞.ppt

第一节 受体细胞Host cell 三、动物转化细胞的筛选 胸苷激酶基因tk， HAT选择法，用氨基蝶呤阻断全合成途径，利用外源胸苷激酶基因合成核苷酸。 突变的二氢叶酸还原酶基因，选择剂为氨甲蝶呤。 黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶XGPRT基因，大肠杆菌XGPRT能够利用黄嘌呤合成GMP，克服霉酚酸对动物细胞的抑制作用。 第四节 核酸的分子杂交分析 在常规的质粒-蝶呤细菌克隆实验中，可通过从抗性菌落提取质粒，进一步采用限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳技术分析重组子。 核酸杂交主要用于筛选文库，也可以用来分析基因的整合与表达情况。 3，生色底物的使用 其中最有名的方法为蓝白筛选。 该方法使用X-gal, 是β-半乳糖苷酶的无色底物. (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)。 乳糖类似物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）可以诱导这一过程，但IPTG不是β-半乳糖苷酶的底物。 The use of chromogenic substrates. induction can also occur if a lactose analogue such as iso-propyl-thiogalactoside is used. This has the advantage of being an inducer without being a substrate forβ-galactosidase. X-gal被分解以后会形成兰色产物，所以β-半乳糖苷酶表达的检测十分容易。该方法可以作为细胞或噬菌斑的筛选方法，或用于检测组织特异性基因的表达. this method can be used in screening for cells or plaques, or as a system for the detection of tissue-specific gene expression in transgenics. Indoxyl derivative---吲哚酚衍生物。 5,5’-dibromo-4,4’-dichloroindigo---二溴二氯靛蓝 galactopyranoside------吡喃型半乳糖苷，oxidised---氧化。 当宿主/载体系统中存在具有功能的β-半乳糖苷酶时可以使用X-gal检测体系，可以分为两种情况： A、载体中存在一个完整的β-半乳糖苷酶基因，如在λ插入型载体中，用缺少β-半乳糖苷酶的宿主细胞扩增噬菌体，所以当载体存在时宿主为Lac+. an intact β-galactosidase gene (lacZ) may be present in the vector, as is the case for the λ insertion vector Charon 16A. Host cells that Lac- are used for propagation of the phage, so that the Lac+ phenotype will only arise when the vector is present. B、α-互补体系， lacZ的一部分由载体携带，C端编码序列位于宿主染色体中； a second approach is to employ theα-complementation system, in which part of the lacZ gene is carried by the vector and the remaining part is carried by the host cell. 载体编码的肽片段称为α-肽，其编码区命名为lacZ′。宿主细胞称为lacZ′-. 当宿主和载体编码产物同时存在时，将产生有功能的β-半乳糖苷酶，并形成兰色的菌落或噬菌斑. 当有外源基因插入时，lacZ′被打断，菌落变为白色。 The smaller, vector-encoded peptide fragment is known as theα-peptide, the region coding for this is designated lacZ′. Host cells are therefore designated lacZ′-. Blue colonies or plaques will only be produced when the host and vector fragments complement each other to produce functional β-galactosidase. 蓝白筛选---scr