[自然科学]核酸分子杂交与应用.ppt

探针的种类 DNA探针：双链或单链DNA探针是最常用的核酸探针。长度在几百碱基对以上。DNA探针又分为： 基因组DNA探针：有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针，多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。 cDNA探针：以mRNA为模板经过逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。 探针的种类 DNA探针优点： 1、一般克隆在质粒载体中，可以无限繁殖； 2、DNA探针不易降解 3、DNA的标记方法比较成熟。 探针的种类 RNA探针：可以是标记分离的RNA，也可以是重组质粒在RNA聚合酶作用下的转录产物。其优点是： RNA探针为单链，复杂性低，与靶序列杂交反应效率极高 因不存在重复序列，因此特异性高 本底低 缺点： 探针的种类 寡核苷酸(oligo)探针：由17～50mer组成的短探针。 优点： 可根据需要人工合成相应的序列； 因片段短，只有一个核苷酸突变，其Tm值也有明显变化，特别适用于点突变的检测 杂交速度快特异性强 缺点：所带标记物少灵敏度低；片段短杂交体不稳定 探针的标记 切口平移法 标记原理：是目前实验室是最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。利用大肠杆菌DNA聚合酶1的多种酶促活性将标记的dNTP掺入新合成DNA链中使探针被标记。 带缺口(nick)的线状、超螺旋及环状双链DNA均可作为切口平移法的模板。 标记步骤 1、取1μgDNA溶于少量无菌蒸馏水中 2、加入μl10x切口平移缓冲液，混匀 10x切口平移缓冲液 0.5mol/L Tris.Cl(pH7.2) 0.1mol/L MgSO4 1mmol/L 二硫苏糖醇(DTT) 500μg/ml 牛血清白蛋白 标记步骤 3、加入除标记核苷酸外的其他三种脱氧核糖核苷酸溶液(也可以是多种标记核苷酸)，20mmol/L溶液各1μl。 以下操作要在同位素工作室中有防护措施的情况下进行操作 4、加入100μCi(10μl)标记的核苷酸溶液。注：应贮存在－20oC冰箱中，使用前在室温下放置15～30分钟融化。要尽量减少冻融次数。 标记步骤 5、加入无菌蒸馏水，至终体积为46.5μl，混匀 6、加入0.5μl稀释的DNase I溶液，混匀 7、加入1μl(5U)DNA聚合酶I溶液，混匀 注：以上操作均在冰浴中进行 8、置14～16oC水浴中保温1～2小时 9、加入2μl 0.5mol/L EDTA终止反应 10、纯化标记的DNA探针 探针的标记 随机引物法 标记原理：随机引物是含有各种可能排列的寡聚核苷酸片段的混合物，可以与任何核酸序列杂交，起到聚合酶促反应的引物作用。将待标记的探针模板与随机引物一起退火，合成标记探针。 标记步骤 1、冰浴中，在一微量离心管内顺序加入下列溶液，并混匀 20mmol/L DTT 1μl 5mmol/L dATP、dGTP、dTTP 1μl 10x随机引物缓冲液 1μl 标记dCTP 3μl 水 1μl 标记步骤 2、取200ng双链DNA溶于1μl蒸馏水中，在蜡膜上与1μl随机引物充分混匀，吸入一毛细玻璃管中，用火封严两端。置沸水浴中30分钟并迅速置冰水浴中1分钟。将DNA转入上述离心管中 3、加入1μl(5U)DNA聚合酶Klenow片段，混匀并离心，室温反应3小时以上 标记步骤 4、取10μl终止缓冲液，置－20oC保存备用 终止缓冲液 50mmol/L Tris.Cl(pH7.5) 50mmol/L NaCl 5mmol/L EDTA 0.5% SDS 随机引物标记法特点 1、除能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA或RNA探针的标记。当用RNA为模板是，操作方法同上，但必须采用反转录酶。 2、标记活性高，只需25ng样品DNA，可在3小时内使40％～60％以上甚至90％的标记dNTP掺入到探针DNA链上 3、操作方便 Southern 印迹杂交过程 1、DNA样品的酶切和电泳 2、电泳胶的处理 3