[自然科学]生物技术实验.doc

生物技术实验 精选 朱嘉明 程龙球 周天鸿 李月琴 梁旭方 方 玲 梁宠荣 马三梅 徐明芳 王 莹 编著 刘大岭 邓 宁 李任强 杨维东 姚冬生 2006年7月 生物技术实验精选 目录 A 遗传·基因工程部分 实验一 果蝇饲养及遗传学研究技术 实验二 人类染色体基本实验技术 实验三 DNA的重组、克隆与鉴定 实验四 功能基因实验技术 实验五 海洋微藻特异基因的转录和表达分析 B 细胞工程部分 实验六 动物细胞培养 实验七 植物组织培养 实验八 植物多倍体诱发和鉴定 实验九 转基因斑马鱼实验 实验十 植物转基因技术 C 微生物工程部分 实验十一 正交试验法在微生物培养条件优化选择中的应用 实验十二 细菌 mRNA的提取及其逆转录 实验十三 微生物生长动力学——细菌生长动力的测定 实验十四 食品、药品和水等的微生物检验技术 D 生物化学技术·酶工程部分 实验十五 蛋白质双向凝胶电泳 实验十六 人基因组 DNA提取 实验十七 植物基因组 DNA提取 实验十八 抗血清的制备与效价测定 实验十九 酶联免疫吸附技术 实验二十 α-地中海贫血的快速基因诊断 实验二十一 从植物材料中提取制备过氧化物酶 实验二十二 海洋微藻的实验室培养与活性成分的分离 实验二十三 天然甲壳素的提取和分离 实验二十四 家兔动脉血压与呼吸运动的调节 实验二十五 模拟过氧化物酶的制备、固定与应用 实验二十六 以枯草杆菌生产蛋白酶 实验二十七 包埋法、交联法对细胞、酶的固定化操作及其比较 备注：红字为精选出来的内容 A 遗传·基因工程部分 实验三 DNA的重组、克隆与鉴定 前 言 ——重组质粒的构建设计 基因工程又称遗传工程、DNA 重组技术、分子克隆等。它是七十年代在分子生物学发展 的基础上形成的新学科。所谓基因工程，就是在分子水平上，用人工方法提取（或合成）某 一生物的遗传物质，在体外切割，拼接和重新组合，然后通过载体把重组的DNA 分子引入受 体细胞，使外源DNA 在受体细胞中进行复制和表达。按人们的意愿定向创造生物新性状，使 之稳定地遗传给下一代。所以基因工程具有广阔的应用前景，即能为工农业生产和工医药保 健等开拓新途径，又能为生物的细胞分化，生长发育，肿瘤发生等基础研究提供有效的实验 手段。 近十余年来，基因工程的发展和应用，迅速地推动了生物科学的发展，目前，基因工程 技术已成为生物学领域许多实验室的常用技术，它的先进性和普及性使人们感到有必要在大 学的教学课程中得到反映。所以，我系已为十几届本科生、研究生开设了基因工程技术实验， 选择一些最基本，最常用的技术，以使同学对基因工程有一个基本的了解，并能掌握一些基 本技术。 但是基因工程的实际技术和实验系统正在不断的创新，新方法、新技术不断推出，而且 在有限的学时内，所能触及的技术只是基因工程中极少的一部分，但从教学角度来看，是不 可能面面俱到。我们只是希望通过本实验，让同学通过基因工程中最基本的技术训练，为今 后独立工作打下基础。 本实验设计主要参考书为T·Maniatis 的《Molecuiar clong》第三版，彭秀玲等编著 的《基因工程实验技术》等。实验中所选择的方法和条件以适合于本实验室设备为首选，具 体参考应用时，可作适当更改。 本套实验设计过程如下： 1. 染色体DNA的抽提 2. PCR 扩增分离目的DNA 片段 3. 载体貭粒的抽提、纯化及检测 4. 载体及目的DNA 片段的限制性核酸内切酶酶切与连接 5. 重组貭粒转化大肠杆菌 6．重组子的筛选、重组质粒的抽提与鉴定 图3－1 重组质粒构建图 1. DNA 的纯度和分子量的测定 一、目的 熟练掌握琼脂糖凝胶电泳法。 利用琼脂糖凝胶电泳测DNA 分子量和质粒DNA分子纯度，并熟悉各种核酸分子在琼脂 糖凝胶电泳中的位置分布和某些特性。 二、原理 琼脂糖是一种直链多糖。它是由B—D 吡喃半乳糖和3，6—脱水半乳糖以1，3—β糖 苷键相连的双糖聚合物，链状琼脂糖分子之间相互以氢键交联。形成网络系统。琼脂糖带有 亲水性，不含有带电荷的基因，也不会引起核酸分子的变性，而且不吸附被分离的物质，因 此成为基因工程上首选的凝胶剂。 当核酸分子在琼脂糖凝胶电场中时，分子上带电基团在pH8.0 条件下带负电荷，在电 场作用中移向正数，至使核酸分子在琼脂糖凝胶电泳中有其迁移率。迁移率与下列因素有关： 1.核酸分子的大小：在相同的条件下，不同大小的核酸分子的迁移率不同，小分子的迁 移率大，大分子的迁移率小。其中线状双链DNA 分子在一定浓度琼脂糖上电泳的速度与线状 双链DNA 分子的分子量对数成反比（图3－1）；所以根据迁移率大小可测定DNA 分子的大小。 不过实际应用时，通常将待测定的DNA 和已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观 察其迁移距离，就可知该