4.DNA复制-2.pptVIP

多起点、双方向（真核） 多起点、单方向（真核） 单起点、单方向（原核） 单起点、双方向（原核） 4.3.3 真核生物DNA复制的过程 SV40DNA的复制 SV40复制起点为64nt，有前期区、中心区和后期区三个功能区。前期区10nt，有不完全回文结构，与其相邻的是T抗原结合位点Ⅰ。中心区23nt，是T抗原结合位点Ⅱ。后期区有17nt的富含AT区，与其相邻的是21bp和72bp区，21bp区富含GC，是转录因子SP1的结合位点。 72bp区是转录和复制的增强子。单独缺失T抗原结合位点Ⅰ或21bp区，复制水平下降30%～50%，二者同时缺失，复制水平下降95%。 (1) 2分子由SV40基因组编码的T抗原六聚体 (相当于E.coli的DnaB蛋白)，在ATP的存在下与SV40复制起始区结合，使起始区的DNA解链。 (2) 复制蛋白A (replication protein A, RPA)作为SSB与单链区结合，提高T抗原的解旋酶活性，使解链区扩大，但RPA与单链DNA结合没有协同效应。 (3) DNApolα-引发酶复合物与T抗原/RPA复合物结合，合成前导链约10nt的RNA引物，和约30nt的DNA。 (4) 复制因子(replication factor, RFC)先与新合成的DNA3-端结合，随后PCNA取代polα-引发酶结合到DNA模板上，前导链的合成暂时中断。 (5) polδ结合到PCNA-RFC复合物上，由于polδ具有校对能力，PCNA与模板DNA结合牢固，该复合物可以持续地，准确地合成前导链。同时，polα-引发酶结合到后随链的模版上，开始后随链的合成。后随链的进一步延伸，也需要用PCNA-polδ或PCNA-polε取代polα-引发酶(图4-20)。 (6) Fen-1-RNaseHl负责切除RNA引物，DNA连接酶I负责连接相邻的冈崎片段，拓扑异构酶I负责清除复制叉移动形成的正超螺旋，拓扑异构酶II a和II b则负责解开连环体，促进最后的2个以共价键相连的连环体DNA分开。 酵母DNA的复制 酵母DNA复制的起点称自主复制序列(autonomously replicationg sequence，ARS)，其长度约为150bp，有几个对ARS功能所必需的保守顺序，如与原核生物9bp序列相似的序列。酵母染色体IV的着丝粒附近为ARS1序列，分为A, B, C三个功能区, A和B起主要作用，C区次要作用。A区为15bp，其中11 bp的保守区称ARS 一致序列(ARS consensus sequence, ACS)，有复制起始子的功能。B区约为80bp，含B1, B2, B3三个功能区，B3是ARS 结合因子-1(ARS-binding factor 1, ABF1)的结合区。 酵母DNA复制的起始需要起点识别复合物(origin recognizing complex, ORC)参与，该复合体由6个亚基组成。相当于原核生物的DnaA。ORC募集两种解旋酶装载蛋白，一种是细胞分裂周期基因6(cell division cycle gene 6, cdc6)表达的蛋白质Cdc6，另一种是Cdc10 依赖性转录因子1(Cdc 10-dependent transcript 1, Cdt1)，随后募集微染色体维持蛋白2-7(minichromosome maintenance protein 2-7, Mcm2-7)复合体。Mcm2-7由6个亚基组成，具有解旋酶活性，功能相当于原核生物的DnaB，至此形成的复合物称前复制复合体(Pre-RC)。 Pre-RC需要依赖于周期素的蛋白激酶(cyclin-depending protein kinase,Cdk)激活才能开始DNA的复制，Cdk和另一种蛋白激酶Ddk可以使pri-RC中的Cdc6和Cdt1磷酸化而失去活性，并脱离pre-RC，DNA聚合酶δ或ε在一些辅助蛋白的协助下被募集到pre-RC上，接着募集polα-引发酶，合成RNA引物和一小段DNA。随后Mcm2-7复合物也被磷酸化，polα-引发酶脱离复合物，pre-RC募集PCNA-RFC，使polδ或DNApolε能够连续的合成DNA链(图4-22)。值得注意的是DNA聚合酶δ或ε与pre-RC的结合先于polα-引发酶，这可以确保在合成RNA引物前，合成前导链和后随链的酶已经到位。Cdk可以激活pre-RC，同时抑制形成新的pre-RC复合物。这可确保DNA在一个细胞周期只合成一次。在细胞完成分裂后，Cdk即被