流式试验数据分析.PDF

第4 章流式實驗數據分析 流式細胞技術，顧名思義就是細胞在流動狀態下的檢測。流動的懸浮液體中分散細胞 一個個地依次通過測量區，該測量區是雷射與液流交會之處，帶有特異性螢光標記抗體的 細胞當暴露於雷射光束時，染色的細胞發出螢光，螢光染劑受到雷射激發，釋放一定波長 的光，這些光信號轉化爲電流信號，再進一步被測量、儲存、顯示，細胞的一系列重要的 物理特性和生化特徵，如大小、內部結構、DNA 、RNA 、蛋白質、抗原等就被快速地測 定。由於流式細胞儀對細胞可進行大量快速準確的測定，每秒可測數千至上萬個細胞，並 可同時進行單一細胞的多參數多抗原的分析，短時間內即可得到大量相關資訊，因此流式 細胞技術在各學科領域越來越受到人們的重視。 4.1 信號之產生及處理 光信號被光電倍增管所偵測，並被 轉換成一個正比例於原來光信號強度的 電壓。光電倍增管所輸出的電流信號， 經由轉換變成 0-10.23 伏特的電壓，再 經由主波放大器將所需之訊號放大（參 見圖），最後再將這些連續性的電壓訊 號，經由一個類比全數位計數器轉換成 0-1023 的整數型數據。 訊號的放大可以使用線性（linear ）或對數（logarithmic ）兩種型態；線性放大器的輸 出與輸入是線性關係，輸入增大 1 倍，輸出也增大 1 倍。測量中有時需要用對數放大器， 它的輸出與輸入是對數關係。如果原來輸出為 l ，當輸入增大到原來的10 倍時，輸出是 2 ；當輸入又增大10 倍時，輸出為 3 ，…等等。對數放大器適用於大多數螢光測量，因為 大多生物學信號變異範圍較大。線性放大器適用在較小範圍內變化的信號，以及代表生物 學線性過程的信號。常見的範例是DNA 分析與鈣離子流動測量，使用線性放大是因為希望 維持螢光訊號與DNA 含量的正比關係。前向及側向散射光的訊號也常使用線性放大，因為 散射光變異範圍較小。 獲取實驗數據之前，先決定訊號放大的型式是相當重要的，選用不同的放大器型式， 將影響實驗數據的分佈，且不易再更改。 BD Biosciences, COE 4-1 4.1.1 條列式數據格式 Listmode Data 細胞儀收集下來的原始數據檔，一般稱之為 Listmode 檔案，意指該檔案是以列表或矩陣方式 儲存。如果用特殊軟體如 FCS Assistant 與 EXCEL 軟體開啟，可見到如下圖中條列式的數 據。所有細胞儀的數據檔都會依據國際公定的 Flow Cytometry Standard File 格式儲存，稱為 FCS 檔案。換言之，各廠牌儀器所得之實驗數據 可相互轉換。 儲存的資料檔案雖然易於加工、處理、分析，但由於資料筆數大，不利於觀察各參數 及其相互的關係。因此將資料用圖形顯示，然後再進行統計分析，是流式結果分析中最常 用、也較客觀的分析方法。圖形顯示通常用一維直方圖、二維散點圖、或三維密度圖、三 維等高圖、假三維圖等，以下簡述。 4.2. 散射光圖譜分析與圈選 在製備好的細胞檢品中，常含有大小不同、形態相異的細胞群體。對於不同的細胞 群，我們常用前方散射與側方散射的二維散點圖， 即散射光圖譜（Scatter Plot ），來畫出不同細胞群 的範圍，選擇有興趣的細胞群體。如右圖為人周邊 血經紅血球溶裂處理後，存活之白血球，用雙參數 散射光圖譜，可區分出顆粒性球、單核球、與淋巴 球三群不同的細胞群。圖中亦可清楚地看出，未被 溶解的紅細胞和一些細胞渣滓，由於不同的體積和 緻密度，明顯地與淋巴細胞區別，從而能把它們分 開。 4.2.1 圈選 Gating 流式用戶可以自行設定分析檔案中的部分數據。配合使用滑鼠在顯示圖上畫定的一個 或數個區域（Region ），用戶可圈選出原始檔中的部分數據，或族群中的部分亞群，進行 資料分析。 BD Biosciences, COE 4-2 圈選可以限定分析的細胞群，而細胞群的界定可以由一個或多個區域組合而成。如從 圖上看到清楚的細胞分群以後，可以在電腦顯示幕上將所要分析的細胞，如淋巴細胞畫線 框出，並通過圈選指令指示軟體，以後就可只對框出部分做各種資料分析。例圖中以散射 光圖譜中的區域來圈選