第10章 蛋白质复性.pptVIP

第十章 蛋白质复性 几种常见的工艺路线（一） 几种常见的工艺路线（二） 几种常见的工艺路线（三） 基因工程包含体的纯化方法 * * 重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径，开辟了现代生物技术发展的新纪元。但是，人们在分离纯化基因工程表达产物时遇到了意想不到的困难，很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物（如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白细胞介素－６、人γ－干扰素等）不仅不能分泌到细胞外、而且在细胞内凝聚成没有生物活性的固体颗粒－包含体（ inclusion bodies IBs) 包含体 包含体（inclusion bodies）是无定形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密，低速离心就可以沉淀。包含体难溶于水中，在变性剂溶液（如盐酸胍、脲）中才能溶解。在这些溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏。因此当除去变性剂时，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型。 包含体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物。这些 基因表达产物的一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。为此，欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。所以，包含体的出现不仅增加了生化工程师生物分离设计的难度，也为生物化学家的蛋白质折叠（protein folding）机理研究提出了新的课题。 机械破碎 (高压匀浆、高速珠磨） 离心提取出包含体 加变性剂溶解 除变性剂复性 特点是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复性。这样首先就摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单了。从这个角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处。 缺点是要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。 机械破碎 膜分离除可溶性蛋白 加变性剂溶解包含体 除变性剂复性 路线（二）应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质，但细胞碎片却和包含体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白质的滞留，因此这条路线的问题比较多。膜分离的优点是封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少。 化学破碎 （加变性剂） 离心除细胞碎片） 除变性剂复性 路线三：是用化学法破菌，所采用的试剂既可以破菌又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后分离带来困难。 目标蛋白的复性 蛋白质复性：以包含体形式表达的蛋白，需要在分离回收包含体后，溶解包含体使其肽链伸展，然后在合适的溶液环境下使目标蛋白质恢复天然构型和活性，这一过程成为蛋白质复性。 常用复性方法： 1、稀释复性：将蛋白质溶液稀释，降低变性剂浓度。 2、添加剂辅助复性：添加具有抑制蛋白质聚集体的生成。 3、分子伴侣辅助复性：抑制蛋白质错误折叠和聚集。 4、反胶团复性：反胶团溶解变性蛋白质，将变形蛋白质分子彼此分割开，阻止分子间相互作用。 5、色谱复性：利用色谱技术将蛋白质与变性剂分开，同时凝胶的网络结构阻滞蛋白质分子间的相互作用。 收集菌体细胞 细胞破碎 包含体的洗涤 目标蛋白的变性溶解 目标蛋白的复性 * *