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植物生理学实验 （多媒体课件） （多媒体课件） 田国政 田国政 湖北民族学院生命科学学院 湖北民族学院生命科学学院 湖北省生物实验教学示范中心 实验15 考马斯亮蓝G－250 实验15 染色法测定蛋白质含量 实验类型：基础验证型 实验学时：3学时 1 实验目的 掌握和学习考马斯亮蓝G－250染色法 测定蛋白质含量的基本方法 2 实验原理 考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中当它 与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光 吸收在465 nm，后者为595 nm。在一定蛋白 质浓度范围内（1-1000 μg），蛋白质与色素结 合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质浓度成 正比，故可用于蛋白质的定量测定。 H -NH- 3 仪器设备、材料和试剂 3.1 主要试剂 3.1.1. 标准蛋白质溶液：称取牛血清白蛋（BSA）10mg，溶 于100mL蒸馏水，配置成100 μg/mL的标准蛋白质溶液。 3.1.2. 考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100 mg考马斯亮蓝G- 250溶于50 mL95 ％的乙醇后，再加入100 mL85％的磷酸， 用水稀释至1 L。 3.2 材料 豆芽：市售新鲜黄豆芽或绿豆芽 3.3 主要设备 离心机 分光光度计 电子天平 4 方法步骤 4.1 标准曲线的绘制 取试管6支按下表操作，摇匀，2～5 min后比色（595 nm），1号管为对照管。作吸光度-蛋白浓度曲线。 管号 1 2 3 4 5 6 100 μg/ml标准蛋白质／mL 0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 蒸馏水／mL 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0 考马斯亮蓝G-250染料／mL 5 吸光度（A ） 4.2 样品蛋白含量测定 4.2 样品蛋白含量测定 准确称取豆芽0.5g，研磨成匀浆后加入用10mL蒸 馏水，４000转/min离心10min，将上清液转入干净的 小烧杯中备用。 准确吸取样品上清液1 m Ｌ置干净试管中，加入考马 斯亮蓝G-250染料5 m Ｌ并摇匀，2～5 min后比色 （595 nm）得吸光度(A)。对照标准曲线求出样品蛋白 含量。 5 实验结果 5 实验结果 利用Excel计算回归曲线、相关系数，用公式计算样 品蛋白质含量 c v × 样品中蛋白质的含量= (T mg/ )g V W 1000 × × S F • 式中 C ： 查标准曲线值，μg VT ：提取液总体积，mL WF：样品鲜重， g