【2018年最新整理】山东省畜牧兽医PCR培训班材料.docVIP

PCR检测技术培训班教材 山东省畜牧兽医总站检验技术中心 二OO七年六月 目 录 PCR的概述 3 蓝耳病病原检测方法 16 高致病性蓝耳病病原检测方法 18 口蹄疫RT-PCR检测方法 20 猪瘟RT-PCR检测方法 22 禽流感病毒通用RT-PCR检测方法 24 禽流感病毒H5亚型RT-PCR检测方法 26 禽流感病毒H7亚型RT-PCR检测方法 28 禽流感病毒H9亚型RT-PCR检测方法 30 新城疫病毒RT-PCR检测方法 32 PCR的概述 PCR即聚合合酶链技术最早于1983由美国的Kary Mullis提出，并用于人基因遗传变异研究，成功地扩增了β-珠蛋白DNA，实现了胎儿镰刀形红细胞贫血病的产前诊断。这一技术的提出可以说是分子生物学技术的伟大创举，人类从此开始大规模地进行基因研究，并取得丰硕成果，这一技术也由于其所做出的巨大贡献，提出者Kary Mullis荣获人类科学的最高奖项诺贝尔化学奖。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq酶）用于PCR，大大简化了PCR的操作，并明显改变了扩增反应的特异性和扩增效率。随着Taq酶的应用和自动扩增仪的诞生，PCR技术更为简便、快速和自动化，PCR的普及应用也随之迅速加快进程，20多年的时间PCR技术迅速渗透到生物科学工作者的各个领域，成为分子生物学技术实验中最基础的技术之一，也可以说是分子生物学实验技术的基石。 一、PCR的分子基础——核酸 在了解PCR之前，我们先来认识一个PCR所依赖的分子理论基础。大家知道进行PCR时，首先需要得到PCR扩增的模板，这里指的模板就是核酸，核酸是细胞内贮存和传递信息的分子，是由很多单核苷酸聚合形成的多聚核苷酸。核苷酸可被水解产生核苷和磷酸，核苷还可再进一步水解，产生戊糖和含氮碱基。 核苷酸中的糖有核糖和脱氧核糖两种。由核糖构成的核酸称为核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）；由脱氧核糖构成的核酸称为脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）。 核苷酸中的碱基均为含氮杂环化合物，它们分别属于嘌呤衍生物和嘧啶衍生物。核苷酸中的嘌呤碱(purine)主要是鸟嘌呤(guanine,G)和腺嘌呤(adenine,A)，嘧啶碱(pyrimidine)主要是胞嘧啶(cytosine,C)、尿嘧啶(uracil,U)和胸腺嘧啶(thymine,T)。DNA和RNA都含有鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)；胸腺嘧啶(T)一般而言只存在于DNA中，不存在于RNA中；而尿嘧啶(U)只存在于RNA中，不存在于DNA中。 核苷酸中的磷酸基因可含1、2、3个，分别称为一磷酸，二磷酸和三磷酸核苷。要合成核酸，必须是三磷酸核苷。 核苷中戊糖的羟基与磷酸以磷酸酯键连接而成为核苷酸。核苷酸之间的连接方式是：一个核苷酸的5′位磷酸与下一位核苷酸的3′-OH形成3′，5′磷酸二酯键，构成不分支的线性大分子，其中磷酸基和戊糖基构成DNA链的骨架，可变部分是碱基排列顺序。核酸是有方向性的分子，即核苷酸的戊糖基的5′位不再与其它核苷酸相连的5′末端，以及核苷酸的戊糖基3′位不再连有其它核苷酸的3′末端。 核酸的合成遵循Watson-Crisk碱基互补配对原则，即严格按照G-C，A-T（U）互补配对，由一条DNA链（模板链）复制出的新链与模板链互补。核酸链的增长按5′→ 3′方向进行，每一次增长一个核苷酸，合成DNA以dNTP为底物，合成RNA则以NTP为底物。DNA的合成需要DNA聚合酶的催化才能实现。以DNA为模板合成RNA的过程称为“转录”，相反以RNA为模板合成DNA的过程称为“反转录”，反转录过程需要反转录酶。 二、PCR定义 PCR(polymerase chain reaction)即聚合酶链反应技术，是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。 三、PCR的发展史 PCR的最早设想：核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 PCR的实现：1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。 PCR的改进与完善：Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：①