[工程科技]现代生物技术实验讲义.pdfVIP

青岛昊航科贸有限公司 现代生物技术实验讲义 DNA重组技术与基因检测芯片技术 动物细胞培养及细胞活性检测技术 发酵工程及分离提取技术 青岛昊航科贸有限公司 第一部分DNA 重组技术与基因检测芯 片技术 1. 相关基础知识 1.1 DNA 重组技术的基本原理 基因工程技术的核心内容就是 DNA 重组技术，即在分子水平上，用人工方法提取或合 成不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合，然后通过载体把重组的 DNA 分子 引入受体细胞，使外源 DNA 在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要生产出不同的产 物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给后代。强调外源核酸分子（一般情况下 都是 DNA ）在不同宿主中的繁殖，打破自然种的界限，将来自不相关物种的基因放入一个 宿主中是 DNA 重组技术的重要特征。另一个特征是繁殖。重组 DNA 技术主要包括以下几 个要素：载体；工具酶；外源 DNA ，即要克隆或表达的DNA 片断；原核或真核宿主细胞。 基因克隆的基本步骤是先用限制性内切酶切割外源 DNA 和载体（质粒 DNA 载体或 噬菌体载体），然后连接酶连接，组成 DNA 重组分子（重组质粒，见图 1），转化入受体细 胞，构建出基因文库，再筛选。除了通常的克隆外，还有亚克隆。初步克隆中的外源片段往 往较长，含有许多目的基因片段以外的 DNA 片段，在诸如表达、序列分析和突变等操作 中不便进行，因此必须将目的基因所对应的一小段 DNA 找出来，这个过程叫“亚克隆” 。 图 1 重组质粒构建示意图 载体的作用是把外源DNA带进宿主细胞，并使之在细胞内建立稳定的遗传状态，在细 胞内繁殖、传代或进行表达。质粒载体是最常见的载体，也是使用最方便的载体。它应用了 质粒的复制、拷贝数及不相容性等性质。质粒载体有抗性基因、琥珀突变抑制基因等多种选 择标记和 α-互补、插入失活等筛选标记。常见的质粒载体有： pBR322 、 pUC18/19 、 pUC118/119 、 pGEM-3Z/4Z 以及一些多功能的质粒载体，如： pBluescript ⅡKS （±）。大肠 杆菌表达载体是最常见的原核表达载体，可分为表达融合蛋白的载体和非融合蛋白表达载 体。常用的标签蛋白有谷胱甘肽转移酶、六聚组氨酸肽、蛋白质 A 和纤维素结合位点等。 1 Tel: +86 532 Fax: +86 532 网站： 地址：山东省崂山区山东头路 58 号盛和大厦 2-1706 青岛昊航科贸有限公司 重组DNA所涉及的工具酶，最主要的是II型限制性内切酶和DNA连接酶。 Ⅱ 型限制性内切酶用来切割DNA ，相当于基因工程中的“剪刀”。II型限制性内切酶识 别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割 DNA ，产生带 3- 羟基和 5- 磷酸基团的 DNA 产物，需 Mg2+ 的存在才能发挥活性。识别序列主要为 4bp ～6bp ，或更长且呈二 重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异。如EcoRI 和 HindⅢ 的识别序列和切割位置如下。 EcoR Ⅰ G ↓AATTC HindⅢ A ↓