色谱分离法96.PPT

凝胶色谱法 又称为交联葡聚糖，是由葡聚糖和甘油通过醚桥（-OCH2CHOHCH2O-）相交链而成的多孔性网状结构物质。 具有亲水性，但不溶于水、稀酸、碱和盐溶液，能在水中溶胀成胶粒，在pH3～10内稳定。 适用于分离水溶性成分如蛋白质、肽、氨基酸、糖及苷类等，应用最为广泛。 凝胶 葡聚糖凝胶 交联葡聚糖的化学结构 凝胶色谱法 葡聚糖凝胶颗粒的网孔大小取决于制备时所添加交联剂的比例。 若交联剂量多，则交联度大，网孔紧密，孔径小，吸水少；反之交联剂量少，则交联度小，网孔稀疏，孔径大，吸水多。 商品型号按交联度大小分类，并以每克干凝胶吸水量10倍的数值来表示，如凝胶G-25型表示吸水量为2.5ml/g的葡聚糖凝胶。 不同规格的葡聚糖凝胶适合用于分离不同分子量的化合物。 凝胶 葡聚糖凝胶 凝胶色谱法 葡聚糖凝胶LH-20分子中引入了亲脂性基团，除了能在水中溶胀外，也能在许多有机溶剂如醇、甲酰胺、丙酮、氯仿等溶剂中溶胀（在醋酸乙酯、甲苯中溶胀不多），并在pH＞2的无氧化剂溶液中呈稳定状态。增大了应用范围，不仅可用于分离水溶性化合物，还可用于分离一些难溶于水或具一定程度亲脂性的化合物（如黄酮、蒽醌、香豆素等）。 凝胶 葡聚糖凝胶LH-20 凝胶色谱法 此外，还有聚丙烯酰胺凝胶（在pH 2～10内稳定，使用情况与葡聚糖凝胶相似），琼脂糖凝胶（适合于分离分子量在百万以上的特大分子化合物），以及结合了不同离子交换基团的葡聚糖凝胶衍生物等。 凝胶 凝胶色谱法 凝胶色谱法分离机理示意图 代表凝胶颗粒 代表大分子物质 代表小分子物质 1、装柱 2、上样 3、洗脱 4、再生 凝胶色谱法 操作步骤 （1）上样前，装好的色谱床至少要用3倍于色谱床体积的洗脱液平衡。 （2）试样上柱前要滤过或离心。 （3）用凝胶色谱收集得到的水溶液组份，若为对热不稳定物质，需进行冷冻干燥。 凝胶色谱法 操作提示 （4）此法具有设备简单、易于操作和所得结果准确等特点，现已发展成为天然药物化学和生物化学研究中一种常规的分离方法。 主要用于天然药物化学成分中大小分子化合物（如蛋白质、酶、多肽、氨基酸、多糖、甾体、苷类及某些黄酮、生物碱等）的分离。 凝胶色谱法 操作提示 薄层色谱法 纸色谱法 电泳技术 干柱色谱法 HPLC GC 活性炭色谱法 一般对极性基团多的化合物的吸附力大于极性基团少的化合物；对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物；对分子量大的化合物的吸附力大于分子量小的化合物。 利用此性质，可使单糖与多糖分离，氨基酸与多肽分离，水溶性芳香族化合物与脂肪族化合物分离等等。实际应用时，应根据所分离物质的特性，选择吸附力适宜的活性炭。 活性炭 活性炭色谱法 色谱用活性炭常分为三类：粉末状活性炭、颗粒状活性炭和锦纶活性炭。 粉末状活性炭吸附力最强，但在色谱过程中流速极慢，需加压或减压操作；颗粒状活性炭在色谱过程中流速易于控制，故色谱分离最常选用；锦纶活性炭吸附力最弱，适于于分离用前两种活性炭不易洗脱的化合物。 活性炭 活性炭色谱法 1、装柱 2、上样 3、洗脱 操作步骤 活性炭色谱法 （1）此法适用于分离水溶性成分如氨基酸、糖类及某些苷类等，具有试样上柱量大，分离效果好等特点，且活性炭价廉易得，适用于大量制备性分离。 （2）目前尚无测定活性炭吸附力级别的理想方法，其吸附力不易控制，故活性炭的具体应用受到一定的限制。 操作提示 聚酰胺色谱法 聚酰胺（商品名又称为绵纶、尼龙）是由酰胺聚合而成的一类高分子化合物。色谱分离常用聚己内酰胺（绵纶6）和聚己二酰己二胺（绵纶66），其中聚己内酰胺可用结构式表示为： 聚酰胺 聚酰胺色谱法 是利用作为固定相的聚酰胺分子内存在的许多酰胺基，能与酚类的羟基、酸类的羧基及醌类的醌基形成氢键而产生吸附，使混合物中各成分得到相互分离的方法。 固定相 移动相 聚酰胺吸附色谱的原理 聚酰胺色谱法 聚酰胺与各种化合物形成氢键的能力不同，决定了聚酰胺对其吸附力的强弱。 形成氢键的能力首先与溶剂的种类有关。 其次，与在含水溶剂中，化合物分子结构对氢键缔合的影响有关。 聚酰胺色谱法 溶剂种类的影响： 在水中最强，在有机溶剂中较弱，在碱性溶剂中最弱。 在聚酰胺柱色谱中常用作洗脱剂的各种溶剂洗脱能力顺序如下：水＜甲醇或乙醇＜丙酮＜稀氢氧化钠液或稀氨溶液＜甲酰胺或二甲基甲酰胺＜尿素水溶液 聚酰胺色谱法 化合物分子结构的影响： （1）化合物分子中能形成氢键的基团数目越多，被聚酰胺吸附越强。 聚酰胺色谱法 化合物分子结构的影响： （2）形成氢键的基团所处位置不同，被吸附的强度也不同。 聚酰胺色谱法 化合物分子结构的影响： （3）分子中芳香核、共轭双键越多，被吸附强度越大。 聚酰胺色谱法 化合物分子结构的影响： （4）化合物若能形成分子内氢键，则被吸附强度减小。 聚酰