生化实验设计1.docVIP

实验设计：酶偶联反应测定血清中的肌酐 一、广泛查阅文献、确定候选方法：经过查阅相关文献，根据方法选择的要求对各种方法进行比较，充分了解各方法的科学依据和真实的使用价值，再根据临床应用价值、实验室条件等综合分析后，目前主要的肌酐测定方法有化学测定法(碱性苦味酸法)、酶法、高效液相层析法、拉曼散射法、同位素稀释质谱法、毛细管电泳法及电极法等。 二、候选方法设计： 实验原理：肌酐经肌酐水合酶催化生成肌酸，肌酸与肌酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶的级联催化作用下生成乳酸，并将NADH变成NAD+，测量在340nm处监测NADH吸光度变化速率，其降低程度与肌酐含量呈正比例，反应式如下 P教材198 反应最适条件探讨：设计一系列实验分别探讨该候选方法的最适试剂浓度、缓冲体系的种类、离子强度、pH值、反应温度和时间、检测波长等。 候选方法的初步试验：——对候选方法做初步评价试验，包括： ①标准曲线和重复性； ②质控血清和新鲜标本的重复试验； ③分析浓度不同的标本，并与公认的参考方法的结果对比。 三、方法学评价： （一）重复性试验：检测候选方法的随机误差。 批内重复性试验：目的是测定实验方法的偶然误差，但产生偶然误差的原因也可能由于仪器、温度、试剂、标准品缺乏稳定性，吸量、计时、混匀等操作缺乏重现性造成，应排除这些因素才能把试验所产生的误差归于方法学的误差。重复性试验依据时间间隔可分为批内、天内、天间三种重复性试验。方法学评价重复性试验应由实验者作批内(或天内)及天间重复性试验 原理： 批内重复性试验是指在相同条件下(用同样的方法，同一种试剂和标准品，同一台仪器，在同一实验室由同一人操作，并保持实验期间准确度不变)对同一标本在尽可能短的时间内进行m轮，每轮n次重复测定，以获得批内精密度数据的试验方法。其结果能反映各次测定结果相互接近的程度，用于客观评价 酶偶联反应测定血清中的肌酐随机误差的大小。 操作步骤：将血清标本用 酶偶联反应测定血清中的肌酐作5轮，每轮4次血糖测定，即可获得20个测定数据。 计算： 1．按照批内精密度的计算公式计算5轮每轮4次测定值的平均数()、标准差(S)和变异系数(CV%)。 首先计算出每轮测定值的均数、标准差(Si)及方差S12 S22 S32 、S 42。再将5轮的总和代入公式即可算出批内标准差Sw。最后计算出变异系数(CV%)。 （二）回收试验：通过计算回收率，检测候选方法的比例系统误差 试剂： 1．血清标本 收集无肝炎病毒、无溶血、无脂浊的人混合血清，用酶偶联反应测定血清中的肌酐，再用生理盐水稀释到一定浓度备用 2．肌酐校准液 3．生理盐水。 4．其它试剂 同酶偶联反应测定血清中的肌酐 操作步骤：1．样品制备 基础样品： 血清0.9ml + 0.1ml生理盐水。 回收样品Ⅰ：血清0.9ml＋0.01ml 80mmol/L肌酐标准液 ＋ 0.09ml生理盐水。 回收样品Ⅱ：血清0.9ml＋0.06ml 80mmol/L肌酐标准液 ＋ 0.04ml生理盐水。 回收样品Ⅲ：血清0.9ml＋0.09ml 80mmol/L肌酐标准液 ＋ 0.01生理盐水。 2．血糖浓度测定 按酶偶联反应测定血清中的肌酐，每份样品作双份检测，结果取平均值。 计算: 1．加入浓度计算:加入浓度(mmol/L)=标准液浓度× 2．回收量计算:回收量＝回收样品测得值－基础样品测得值 3．回收率计算:回收率(%)=×100 请将各计算结果填入表2-4内。 表2-4 回收试验的数据处理 样 品 测得浓度 加入浓度 回收浓度 回收率(%) (umol/L) (umol/L) (umol/L) 基础样品 回收样品Ⅰ 回收样品Ⅱ 回收样品Ⅲ 平均回收率。 (三)干扰试验：通过计算干扰值，检测候选方法的恒定系统误差。 试剂： 1．血清标本 收集无肝炎病毒、无溶血、无脂浊的人混合血清，用酶偶联反应测定血清中的肌酐，再用生理盐水稀释到一定浓度备用 2．肌酐校准液 3．生理盐水。 4．其它试剂 同酶偶联反应测定血清中的肌酐 操作步骤： 1．样品制备 基础样品：血清0.9ml＋蒸馏水0.1ml。 干扰样品Ⅰ：血清0.9ml＋9.0mmol/L肌酐标准液0.05ml+蒸馏水0.05ml。 干扰样品Ⅱ：血清0.9ml＋9.0mmol/L肌酐标准液0.1ml。 血液样品：蒸馏水0.9ml＋9.0mmol/L肌酐标准液0.1ml。 2．肌酐值的测定 按酶偶联反应测定血清中的肌酐 计算： 1