人类基因重组和人类基因工程.ppt

基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering; 基因重组 是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子的过程，又称DNA重组。 基因克隆 将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的同一DNA分子，称此为基因克隆、DNA克隆或分子克隆。 基因工程 实现基因克隆所采用的方法和相关工作，统称为重组DNA技术或基因工程。;重组DNA;;;第一节自然界DNA重组和基因转移是经常发生的 DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature;自然界中DNA重组;（一）接合作用;细菌的接合作用;可接合质粒如 F 因子(F factor) ;（三）转导作用;λ噬菌体的生活史;;发生在姐妹染色单体之间或同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组（general recombination）。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。;Holliday模型的4个关键步骤： ;片段重组体 （见模型图右边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组 体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。; 内切酶 (recBCD);Holiday中间体;;λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合。;;2、细菌的特异位点重组;hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。; H2鞭毛蛋白;（三）、转座重组（P350); 插入序列(insertion sequences, IS)组成：;插入序列发生转座的形式：;;插入序列的复制性转座;转座子(transposons) ——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。;由转座子介导的转座;第二节 重组DNA技术又称DNA克隆或分子克隆 ;相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 重组DNA技术与医学的关系;一、重组DNA技术相关概念;技术水平：分子克隆(molecular clone) （即DNA 克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）　;应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质??同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 ; 目的： ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）;（二）工具酶;重组DNA技术中常用的工具酶;限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) ;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;Bam HⅠ;⑴ 一种是在对称轴5’ 端切割产生5‘-突出末端;来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。;有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。;（三）目的基因(target gene) ;（四）基因载体;克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。;载体的选择标准：;质粒 (plasmid);① 4363 bp ② 含一个复制点 ③含一个抗氨卞青霉素标记(ampR) ④ 一个抗四环素标记 (tetR) ⑤ampR和tetR基因内各有一些限制酶的酶切位点， 供外源基因插入 当外原基因插入抗药基因位点时，AmpR→Amp敏感(AmpS )、TetR→Tet敏感(TetS).; λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）; 由pBR322和M13噬菌体