RT-PCR同济分生.pptVIP

实验二 目的基因的获取 以小鼠脾脏为组织来源, 利用RT-PCR的方法获取目的基因 1. 总RNA的提取 2. mRNA为模板, 逆转录为cDNA 3. cDNA为模板PCR扩增目的基因 常用的逆转录酶： 鸟类成髓细胞瘤病毒（AMV） 鼠白血病病毒莫勒尼株（M-MLV） 嗜热热稳定TthDNA聚合酶 常用的逆转录酶： 鸟类成髓细胞瘤病毒（AMV） 鼠白血病病毒莫勒尼株（M-MLV） 嗜热热稳定TthDNA聚合酶 保证RNA均一、完整 常用的RNA酶抑制剂 操作步骤： 逆转录 5×buffer 4μl dNTP（10 mmol/L） 1μl oligo(dT) 1μl 模板RNA（0.1-0.8 μg） 5μl AMV 1μl RNsin 0.5μl H2O 7.5μl 总体积 20 μl 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction PCR PCR标准反应体系 1 cycle: three steps Denaturation Annealing Extending PCR的基本原理 PCR的基本原理 变性、复性、半保留复制 PCR三步曲 变性 90～97℃ 退火 45～55℃ 延伸 72℃左右 PCR反应条件的控制 （一）PCR反应的缓冲溶液 提供合适的酸碱度和某些离子 10～50mmol/L Tris-HCl缓冲液 50mmol/L KCl BSA或明胶 （二）镁离子浓度 Taq酶活性需要Mg2+ ， Mg2+浓度过高导致非特异扩增。 一般常用1.5mmol/L （三）底物浓度 dNTP浓度在20～200 ?mol/L 四种dNTP必须浓度相等 （四） Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在70～80℃具有最高聚合活性 （五）引物 引物浓度一般为0.1～ 0.5?mol/L （六）反应温度和循环次数 变性温度和时间 95℃/30 ～60s 退火温度和时间 45～55℃/30 ～60s 延伸温度和时间 72℃ 循环次数 25～30 不超过35 PCR产物鉴定 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 六、PCR中应注意的事项 PCR反应中可能出现的问题： 无扩增条带 出现非特异扩增带 假阳性 拖尾 （一）防止污染 试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作 （二）设立对照： 阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板 试剂对照： 除模板外的所有组分 PCR常见问题之一 无扩增产物 PCR常见问题之二 PCR常见问题之二 PCR常见问题之三 PCR常见问题之三 PCR常见问题之四 band of correct size A unique 理想PCR产物: 注意的事项： 模板:含有抑制物，含量低 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 原因 对 策 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间 非特异性扩增 现象：PCR扩增后出现与预计的大小不一致的条带。 引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多 原因 对 策 重新设计引物 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度 减少循环次数 非特异性扩增 拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 M 1 2 模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多 原因 对 策 纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数 拖尾 * * The Central Dogma transcription translation Reverse transcription replication RT-PCR AAAAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTT cDNA RT-PCR RT-PCR—一步法和两步法 RT-PCR—一步法和两步法 干烤玻璃器皿，180℃6h以上；Ep管，Tip头等塑料制品用0.1%DEPC溶液浸泡过夜，高压消毒，烘干（DEPC剧毒，须在通风橱中小心使用）。