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蛋白质的测定（微量凯氏定氮法） 王曦 201100140161 一、实验目的 1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。 2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。 二、实验原理 蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4→2CO2+3SO2+4H2O+NH3 2NH3+H2SO4→（NH4）2SO4 （NH4）2SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH3↑ 为了加速消化，可加入硫酸铜作催化剂，及硫酸钾以提高溶液沸点，收集氨可用硼酸溶液，氨与溶液中的氢离子结合生成铵离子，指示剂的颜色发生改变，然后用强酸滴定。 三、实验试剂及器材 1、凯氏定氮仪 1、人的血清蛋白 2、电炉 2、浓硫酸（A.R） 3、消化架 3、30%NaOH溶液 4、锥形瓶（*3） 4、2%硼酸溶液 5、量筒10ml 5、甲基红指示剂 6、碱式滴定管5ml 6、0.01mol/L盐酸溶液 7、凯氏烧瓶 7、0.3mg/mL硫酸铵溶液 8、滴管 四、实验步骤 1．样品的消化 将两个50mL的凯氏定氮烧瓶编号（在烧瓶口附近），一只烧瓶内加1.0mL蒸馏水，作为空白。另一只烧瓶内加入1.0mL样液。然后用取样器各加浓硫酸4mL（取浓硫酸时勿溅到衣物和皮肤上，也不要洒到实验桌上），用药勺加硫酸钾－硫酸铜混合物约200mg（不必称重，一点点即可），所有试剂要尽量加到凯氏定氮烧瓶的底部。烧瓶口插上小漏斗（作冷凝用），烧瓶置通风橱内的电炉上加热消化，注意先启动抽风机在消化开始时，应控制火力，不要使沸液冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明蓝绿色为止。消化时间为2～3h，冷却，准备蒸馏。在消化时 可以同时进行第二步。 2、定氮仪的洗涤 蒸气发生器中装加有H2SO4的蒸馏水和数粒沸石，加甲基橙指示剂后显粉红色。加热后，产生的蒸汽经贮液管、反应室至冷凝管，冷凝液体流入接受锥形瓶瓶。每次使用前，需用蒸汽洗涤5分钟左右（此时可用一小烧杯承接冷凝水）。将一只盛有5mL 2％硼酸液和1 ~ 2滴混合指示剂的锥形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管口插入液体中，继续蒸馏3分钟，如硼酸液颜色不变，表明仪器已洗净。若硼酸的颜色变为淡绿色，说明定氮仪内有残留氨，需要进一步用蒸汽洗涤。若反应室内有上次操作剩余的残夜，可以通过图1中7向反应式加冷的蒸馏水，然后短时间关闭4，要注意观察3中的液面高低，不要让液体溅出。则残夜会倒吸回贮液管，重复几次，并用蒸汽洗涤几分钟，再用上述方法检验是否已经洗干净。打开12废液排出管的夹子可以将废液放出。 3、滴定练习 仪器洗好后，取一100ml锥形瓶，加入5ml硼酸溶液，并使冷凝管下端玻璃管插入硼酸溶液中。取下11（图1）棒状玻璃塞，利用2ml移液管准确向反应室加入2ml硫酸铵溶液，然后将玻璃塞放回，缓慢取下帮装玻璃塞，但注意不要把液体全部放完，加入蒸馏水两三次，但每一次都不要把水放完，要注意一直要有水封。向7（图1）玻璃杯中加入10ml30%NaOH溶液，旋转棒状玻璃塞，将氢氧化钠溶液缓慢地放入反应室中，并留少量液体作水封，再加入蒸馏水两三次，注意水封。等到锥形瓶内的硼酸溶液由紫红色变为鲜绿色后开始计时，继续蒸馏3min,然后移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm，继续蒸馏1min。并用少量蒸馏水洗涤冷凝口外围，移去锥形瓶。立即用标准盐酸溶液进行滴定，如果用滴定结果计算出的标准硫酸铵中氮含量接近于0.3mg/ml。则说明整个实验操作正确，可以进行下一步。 4、样品测定 仪器洗好后，取一100ml锥形瓶，加入5ml硼酸溶液，并使冷凝管下端玻璃管插入硼酸溶液中。取下11棒状玻璃塞，利用2ml移液管准确向反应室加入2ml消化好的样品溶液，不要全部放出，留少量做水封，加蒸馏水2、3次，留少量水封。加入蒸馏水向7玻璃杯中加入10ml3