采用固定化金属螯合亲和层析法IMAC生产重组末端转移酶.PDFVIP

采用固定化金属螯合亲和层析法（IMAC）生产重组末端转移酶 序言 在罗氏本部，我们生产出种类繁多的重组蛋白，供以生命科学实验应用。在蛋白的小试和 放大生产时，最为重要的参数是表达蛋白的产量、生产速度和生产环境安全性。在本文中， 我们描述了罗氏在大肠杆菌中重组表达的真核细胞末端转移酶（Terminal Transferase, TdT ） 的纯化策略，该酶主要应用于克隆实验和核酸标记实验。 用于重组酶表达生产的大肠杆菌菌株中通常携带了多种不同的核酸代谢酶类。但是如将末 端转移酶应用于分子生物学实验，商品化的酶中绝对不能含有酶污染物，如核酸酶。因此 需要采取一系列不同的纯化步骤纯化重组的TdT 。 本文中我们应用了镍离子IMAC 法纯化His 标签标记的TdT 。His 标签不会影响蛋白产品功 能性，同时简化了纯化过程并且降低了成本，因此是非常理想的蛋白标签选择。 在体内，TdT 的作用决定了免疫球蛋白和T 细胞受体的高度多样性。TdT 能以未标记或已标 记的三磷酸盐为底物，从而实现了实验室和工业上的多种研究应用 （如寡核苷酸末端加尾、 细胞原位凋亡检测、T/A 克隆以及RACE“cDNA 末端快速扩增” ）。 研究目的 纯化重组的TdT ，其中不能检出其他酶活污染。 蛋白表达 重组末端转移酶（TdT ）在E. coli K12 UT5600 菌株中进行过度表达，收集菌液作为TdT 纯 化的初始材料。细胞裂解并除去核酸后，经过一系列层析步骤进行纯化。TdT 纯化温度为 +2 至+8°C。 缓冲液制备 缓冲液A ：50 mM Tris/HCl pH 7.6, 0.5 M NaCl, 50 mM LiCl 缓冲液B：50 mM K-PO4 pH 6.0, 5%甘油 缓冲液C：50 mM Tris/HCl pH 7.6, 0.5 M NaCl, 5%甘油 细胞裂解 81 克E. coli K12 UT5600 细胞与1L 缓冲液A 混合，重悬菌液。在悬液中加入PMSF （0.1M）， 至最终浓度为0.1 mmol/L。 随后在冷却状态下（温度+10°C）通过高压分散细胞（Gaulin Lab-60 ）使细胞裂解。得到 裂解度40-50%的细胞悬液。 核酸去除 采用Polymin 沉淀法去除悬液中的核酸：将45ml 10%的Polymin-P 溶液滴加到细胞悬液。 完全沉淀后，溶液在+2 至+8°C 下孵育30 分钟。孵育完成后，离心（30min，8,000 × g， +2 至+8°C）去除沉淀。使用缓冲液B 透析处理上清。 层析纯化 ® POROS HS 50 层析 ® POROS HS 50 column 在含0.2M NaCl 的缓冲液B 中进行平衡后，加入经离心透析的上清， 使用含0.2M NaCl 的缓冲液B 进行洗涤。采用线性梯度的含0.2M NaCl 至1M NaCl 的缓冲 液B 洗脱酶。TdT 在NaCl 浓度为300 mM 至700 mM 范围内获得洗脱。 采用cOmplete His-Tag Purification Resin 进行层析 ® POROS HS 50 层析获得的含TdT 溶液中，使用K HPO 将溶液pH 调整为7.5，加入咪唑储 2 4 备溶液将咪唑浓度调整为10 mM。 在直径1.6 cm 的XK 柱（GE Healthcare ）中装载10ml cOmplete His-Tag Purification Resin ， 在含10 mM 咪唑的缓冲液C 中平衡柱体。随后将TdT 溶液上柱，采用含20mM 咪唑的缓 冲液C 洗柱，再次采用含30mM 咪唑的缓冲液C 洗柱。 层析流程在Äkta Purifier 100 上进行，所有步骤（平衡、样品装载、洗涤和洗脱）的流速均 采用2ml/min。 采用线性梯度的含30mM 至1M 咪唑的缓冲液C 将His-标签重组酶洗脱。酶在咪唑浓度 50mM 至200 mM 的范围内被洗脱（图1）。洗脱过程中收集的溶液在SDS 胶上分析蛋白纯 度（图2 ），其中可见的蛋白杂带（见第3 道下半部分）可在Phenyl Sepharose FF 上进一步 纯化去除（见第4 道）。 图1：在cOmplete His-Tag Purification Resin 上纯化重组TdT 图2：采用cOmplete His-Tag Pur