分子生物学实验讨论课.ppt

讨论课 PCR产物 A-T克隆 测序 重组表达载体 重 组 蛋 白 制备抗体 转 染 细 胞 (1)PCR (2)核酸的纯化：凝胶回收Kit (3)连接反应：16℃过夜/22 ℃ 2h (4)CaCl2法制备感受态细胞：Kit (5)宿主菌的转化及蓝白筛选 (6)挑克隆：2ml 含抗生素的LB (7)提质粒：Kit (8)重组质粒的鉴定：双酶切反应、菌落PCR (9)测序：生物技术服务公司 (10)菌种保存: 20~30%甘油-菌液，-20/-70 ℃ 步骤： (11)外源基因在哺乳动物细胞中的表达：质粒转染、电转染 (12)目的基因表达的鉴定：RT-PCR、Northern Blot、 原位杂交、Southern Blot (13)目的蛋白表达的检测： 原核表达：SDS(重组蛋白诱导表达的诱导剂浓度、 诱导时间和温度、重组蛋白表达的形式)、WB 真核表达：Western Blot、ELISA、免疫组化 (14)重组蛋白的纯化：亲和层析，His-tag/GST-tag (15)制备抗体：多抗和单抗 (16)基因功能检测：提高/降低表达水平 细胞周期检测：流式细胞仪 细胞增殖检测：MTT 细胞凋亡检测: 流式细胞仪、TUNEL、DNA Ladder 抑瘤活性检测：体外、体内 对血管化的影响 。。。。。。。 (17)作用机制 1. 核酸的分离纯化和鉴定: 基因组DNA、总RNA、质粒 2. 基因的克隆与鉴定方法 3. 外源基因转移技术和表达体系 4. 检测方法：电泳技术：agarose、SDS 分子杂交: SB、NB、WB、基因芯片技术 DNA序列测定 生物信息学分析技术 5. 基因功能研究的方法 6. 组学研究技术：基因组学、蛋白质组学 方法的分类： 3 - 4 小时 1.PCR a.模板DNA：单链或双链DNA, 避免DNA聚合酶抑制剂和能结合 DNA的蛋白质污染。 b.引物：人工合成的两段与待扩增靶DNA侧翼片段互补的寡核苷酸。 0.1~0.5 µmol/L c.Mg2+的浓度：反应产物的特异性和产量，1.5mmol/L。 d.dNTP：50~200µmol/L，四种dNTP浓度相同。 e.Taq 酶：Klenow / Taq酶 / 高保真Taq酶, 2.5U/100μl 。 f.参数：94℃ 5min - 30×(94℃ 30sec - 55 ℃ 30sec - 72℃1 min) - 72 ℃7min 组成 思考题1： 做PCR实验之前，你应该做哪些准备工作？ 1.目的片段大小 2. 仪器设备 3. 试剂 4. PCR参数 影响因素 模板：ng级的质粒DNA，μg级基因组DNA。 引物：特异性 dNTPs浓度：正确性和产量 Taq酶用量：非特异性 循环参数：常规为25~30个循环 特异性条带弱，非特异性条带弱 无特异性目的带，非特异性条带弱 特异性条带明显，非特异性明显 特异性条带弱，非特异性显著 无特异性目的带，非特异性条带强 载体信息 目的片段酶切位点 读框 上游有标签 下游有标签 读框 终止码 不用 5’ 保护碱基+ 酶切位点+ 起始密码 +目的基因5’末端序列 3’ 1 atg aat ttt caa cag agg ctg caa agc ctg tgg act tta gcc aga 45 1 M N F Q Q R L Q S L W T L A R 15 上游引物 上游有标签 读框 586 ctt ctg acc tgg atg cag aaa ttc tac aag ctc tga 621 196 L L T W M Q K F Y K L * 下游引物: 反向互补 5’ 保护碱基+ 酶切位点+ 终止密码 +目的基因3’末端反向互补序列 3’ 下游有标签 读框 5’ ccc aag ctt a 3’ ggg ttc gaa t 。。。。 ac ggt acc