一种从活性污泥中提取微生物总DNA的方法.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（７）：９７～９９ 一种从活性污泥中提取微生物总ＤＮＡ的方法  郑　维　权春善 　朴永哲　王军华　范圣第 （大连民族学院生物技术与资源利用国家民委教育部重点实验室　大连　１１６６００） 摘要　对活性污泥的微生物群落进行研究的首要前提是获得大量的高纯度微生物基因组ＤＮＡ。 建立了一种高效、简便的提取活性污泥总ＤＮＡ方法。从提取的核酸总量、纯度、基因组完整性等 多方面对所得到的ＤＮＡ质量进行了评价，结果表明，从单位活性污泥中提取的ＤＮＡ得率为１０５ ～８２３ｇ／ｇ，结构完整，纯度很高，无需进一步的纯化，可直接进行微生物群落分析及构建文库等 μ 后续分子生物学操作。现在实验室使用的提取活性污泥中ＤＮＡ的方法，纯度普遍都无法达到 ＰＣＲ反应和建立文库的要求，建立的活性污泥ＤＮＡ提取方法则可以克服这一难题。 关键词　活性污泥　ＤＮＡ提取　ＰＥＧ　１６ＳｒＤＮＡ 中图分类号　Ｑ５２３ 　　活性污泥是以细菌、微型动物为主的微生物与悬 泥中的染色体 ＤＮＡ，最终获得了高浓度和高纯度的完 浮物质、胶体物质混杂在一起所形成的茶褐色的絮凝 整染色体ＤＮＡ，并发现无需进一步纯化即可直接进行 体，是生物方法处理工业和城市污水的主体。由于污 后续分子生物学操作，为活性污泥微生物群落分析打 泥成分较复杂，所处的环境较特殊，因此微生物在种类 下良好的基础。 和数量上都应比其他环境丰富，并?藏着大量尚未被 １　材料与方法 人类开发的功能基因。由于传统的纯培养方法很难真 实、全面的反映污泥中的微生物种群结构，因此人们对 １．１　材　料 污泥中的微生物了解甚少，尤其是降解特殊化合物的 　　污泥提取于大连市污水处理厂和大连经济技术开 微生物的了解甚少。利用分子生物学技术对污泥进行 发区污水处理厂的二沉池，马栏河排污处等处，样品依 菌群动态跟踪和功能菌群鉴定，了解细菌区系和种群 次编号为 ＤＬ８、ＤＬ１０、ＤＫ８、ＤＫ１０、ＭＫ８、ＭＫ１０。ＣＴＡＢ 数量，认识细菌群落的稳定性和一些功能菌在有害物 （Ａｍｒｅｓｃｏ）、ＰＥＧ８０００（Ａｍｒｅｓｃｏ）、裂解酶（Ａｍｒｅｓｃｏ）、Ｅｘ 降解中的功能和作用，揭示菌群结构与功能的关系，从 ＴＭ Ｔａｑ 、ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄＩＩＩ来自宝生物工程（大连）有限 而可以进一步优化活性污泥法生物处理系统运行，提 公司，其余化学试剂均为国产。 高废水处理效果［１～３］。近年来，有关从土壤、水体、海 １．２　样品预处理 洋沉积中提取ＤＮＡ的方法已得到较好发展［４，５］，但对 　　将采集的污泥（水）迅速带回实验室，立即离心 １０ 活性污泥总 ＤＮＡ的提取方法研究较少。由于活性污 ｍｉｎ（８０００×ｇ，４℃），弃去上层污水，称取１０ｇ活性污 泥细菌种类组成复杂且混杂有大量有毒物质，如何使 泥样品用适量的磷酸钠缓冲液（ｐＨ８．０）洗涤两次，离 所有细胞裂解、充分释放 ＤＮＡ，有效去除杂质，得到可 心１０ｍｉｎ（８０００×ｇ，４℃），弃上清液，－７０℃保存。 以进行分子生物学操作的高纯度 ＤＮＡ是研究活性污 １．３　活性污泥总ＤＮＡ的提取 泥种群结构与