农杆菌渗透法转化烟草条件的优化-江苏农业科学.PDFVIP

江苏农业科学　２０１４年第４２卷第９期 — ４５— 李晓君，王绍梅，谢艳兰，等．农杆菌渗透法转化烟草条件的优化［Ｊ］．江苏农业科学，２０１４，４２（９）：４５－４７． 农杆菌渗透法转化烟草条件的优化 李晓君，王绍梅，谢艳兰，和　敏 （临沧师范高等专科学校农学系，云南临沧６７７０００） 　　摘要：植物瞬时表达系统常用于研究基因表达产物的亚细胞定位和蛋白间的互作，将ＧＦＰ－ＧＵＳ融合蛋白植物表 达载体导入农杆菌ＥＨＡ１０５，获得工程菌，制备不同浓度的农杆菌浸染液，用注射法对烟草叶片进行转化，荧光显微镜 检测烟草叶片原生质体和下表皮中ＧＦＰ的表达情况。结果表明，浸染注射液的Ｄ 在０．３～０．７之间均具有较高的 ６００ｎｍ 转化效率，注射后第４天至第６天为较佳观察时间。 　　关键词：植物瞬时表达系统；渗透法；转化；农杆菌渗透注射；烟草；绿色荧光蛋白（ＧＦＰ） 　　中图分类号：Ｓ５７２．０１　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１４）０９－００４５－０３ 　　植物瞬时表达系统常用于基因产物的亚细胞定位、蛋白 生质体，进行原生质体培养后再检测 目标基因的表达情 ［４］ 间互作、转录因子与启动子之间的互作、启动子分析等方面的 况 。用该方法转化后的原生质体敏感、易破裂，使得阳性 ［１－２］ 研究 。植物瞬时表达系统中外源基因的导入方法有植物 细胞检出率低，不利于观察。以农杆菌渗透法转化材料提取 ［２］ 病毒介导法、ＰＥＧ法、电击法、基因枪法和农杆菌渗透法 。 原生质体，可缩短从原生质体提取到观察的时间，原生质体完 ［５］ 农杆菌渗透法是一种比较简便的方法，通过将植物表达载体 整，镜检阳性率高。本研究在Ｓｐａｒｋｅ等的研究基础 上简化 导入农杆菌，用真空法或注射法将农杆菌导入植物细胞，使得 了农杆菌注射液的制备和注射过程，通过荧光显微镜观察注 农杆菌 Ｔｉ质粒上的 Ｔ－ＤＮＡ区整合到植物基因组中， 射区域下表皮和原生质体中绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）的表达情 ［３］ Ｔ－ＤＮＡ区的目标基因培养几天后即可得到表达 。较其他 况，检测不同注射浓度下和注射后不同时间的转化效率，总结 方法而言，农杆菌渗透法具有转化效率高、基因表达在完整活 出一种高效简易的农杆菌渗透注射转化烟草的方法。 ［２］ 体内进行、可携带较大片段的目的基因等优点 。原生质体 １　材料与方法 是观察基因瞬时表达情况的优选材料，传统的原生质体转化 方法首先要制备高浓度、高质量的质粒，经过从植物活体材料 １．１　材料与仪器 中分离纯化原生质体，在ＰＥＧ的介导下将质粒 ＤＮＡ导入原 １．１．１　植物材料　将普通烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）种子播撒 在育苗盘中，２周后移至小花盆，５～６周后即可作为转化 收稿日期：２０１３－１１－２５