[理学]第三章2核酸的结构与功能.ppt

1.碱基(base)：基本碱基结构和命名 DNA一级结构的表示法 2. RNA的一级结构与功能 3.3.2 维持DNA双螺旋的作用力 DNA分子间的三链结构 真核生物染色体DNA组装不同层次的结构 酵母tRNAAla 的二级结构 DNA的变性过程 DNA的变性温度： 通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值50%时的温度称为DNA的变性温度（融解温度，Tm）。 Tm（ melting temperature）是使DNA双螺旋链解开一半时的温度。DNA Tm一般在70—85℃之间。 影响DNA Tm值的因素: (1) DNA的均一性, 均一性高, 熔解过程会发生在一个很窄的范围内。 (2) G+C 的含量, 含量越高, Tm值越高。经验公式为: (G+C)%=(Tm-69.3) ×2.44 Tm值计算公式：Tm＝69.3+0.41（G+C)% ， ＜25 bp的寡核苷酸的Tm计算：Tm＝4（G+C）+2（A+T）。 (3) 溶液中的离子强度: 一般来说, 离子强度低, 熔解温度低, 熔解温度范围宽。 3.7.2 核酸的复性与分子杂交 1.核酸的复性(renaturation)及复性条件 指变性DNA在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程(又称退火, annealing) 。DNA的复性有两个必要条件： ①一定的离子强度，用于削弱两条链中磷酸基团之间的排斥力，通常使用0.15～0.50 mol/L NaCl； ②较高的温度，用以避免随机形成的无规则氢键，但也不能太高，否则不能形成有效的氢键以维持稳定的双链。 2. DNA的复性动力学曲线 复性过程基本上符合二级反应动力学。 双链DNA的复性过程方程是：dsDNA 2ssDNA 根据二级反应动力学公式： dC/dt= - K2C02 将上式积分： C/C0= 1/(1+K2?C0t) 当C/Co=1/2 (即复性至一半) C0t1/2=1/K2∝Х K1 K2 以C/C0对C0t作图得到C0t曲线。 Cotl/2与基因组的复杂性呈正比。 复杂性 DNA顺序（基因组）的复杂性（Х）：是指基因组中不同序列的总和。基因组的复杂性是通过DNA变性和复性实验发现的,用非重复碱基对数来表示核酸分子的复杂性。 在通常使用的标准状况下(0.18 mol/L的阳离子，片断大小400个核苷酸，复性温度为Tm-25℃), K2=5×105 (L?核苷酸／mol?s)，即在此条件下，Х＝5×105Cot1/2(核苷酸对)。 3. 复性程度的检测 1) 测定减色效应 2）测定S1核酸酶水解DNA的量 3）羟基磷灰石柱层析 4. 影响DNA复性速度的因素 (1) 在同样条件下,序列复杂的分子比序列简单的分子复性时间要长。 (2) DNA浓度越大,复性速度越快。 (3) DNA片段的大小,大片段复性速度慢。 (4) 温度,一般比熔点低25?C左右为最隹。 (5) 溶液离子强度, 一般有一定浓度的盐。 5.核酸的分子杂交： 两条来源不同的单链核酸（DNA或RNA），只要它们有大致相同的互补碱基顺序，经退火处理即可复性，形成新的杂种双螺旋，这一现象称为核酸的分子杂交。 1) 单链DNA-单链DNA--→双链DNA分子； 2) 单链DNA-单链RNA--→DNA-RNA杂交分子； 3) RNA--RNA--→RNA-RNA杂交分子。 分子杂交(简称杂交,hybridization)是核酸研究中一项最基本的实验技术。其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质,使来源不同的DNA(或RNA)片段,按碱基互补关系形成杂交双链分子(heteroduplex)。 目前实验室中应用最广的是用硝酸纤维素膜作支持物进行的杂交。 Southern印迹法：DNA-DNA分子杂交技术。 Nouthern印迹法：DNA-RNA分子杂交技术。 Western印迹法：利用抗原-抗体反应，分析蛋白质的技术。 此讲结束！ Edwen Southern 1975年首先提出 功能 A 稳定真核生物染色体结构 B 保证DNA末端准确复制 C 与DNA分子的组装有关 D 与染色体的meiosis mitosis 有关 Hoogsteen Bonding 5’-----TTAGGGTTAGGGTTAGGGT