衣藻遗传转化系统-南开大学生物教学中心.pptVIP

概述 莱茵衣藻属于绿藻门团藻目衣藻属，带有鞭毛的单细胞真核生物。虽然衣藻是真核生物的一员，但是衣藻的结构简单，原生质膜紧贴着细胞壁，具有两根鞭毛，侧面具有一个眼点，其中最重要的一个特点是具有一个占细胞总体积40%左右的杯状叶绿体。同时其培养方法近似于微生物，生长周期相对于其他真核生物比较短，这些条件为进行遗传学分析提供了便利条件。 ?????????? 衣藻遗传转化系统 实验组所用的莱茵衣藻是德国进口的去细胞壁的精氨酸缺陷型衣藻，然后用PARG7.8Φ3为筛选标记对国产玻璃珠转化效果进行探索性实验，寻找一套简易廉价的衣藻遗传转化系统，进而可以应用于本科生实验教学当中；另一方面，可以降低衣藻遗传转化的成本，衣藻作为新的受体生物的价值也将提高。 衣藻作为遗传实验材料的优点 1.基因组序列比较清楚，可做到定点整合。 2.易获得系列突变体。 3.生活周期短，有转化方法的相关资料可参阅。 4.单细胞并具有高等生物的特性，可用类似于细菌的方式进行培养。 一、实验原理 植物遗传转化是植物基因工程中最重要、最关键的操作步骤之一。遗传转化是通过载体构建和适宜的转化方法，将目的基因转入宿主中, 通过外源基因的表达筛选具有目标性状的转基因植株，最终获得高品质、抗病、抗逆或合成某些生物活性物质的新植物品种。 本次实验选择衣藻作为遗传转化材料的原因首先是衣藻为单细胞真核绿藻，它具备原核生物的很多特点，比如培养条件简单，既可以以液体培养也可以在固体培养基上生长。容易通过诱变获得系列突变体，提供研究真核生物相关基因功能与表达调控的材料。作为真核生物它具备了与模型生物酵母类似的真核生物基本特性，比如除主基因组所在的细胞核以外，还拥有有独立基因组的线粒体；由于基因有内含子，所以具有一般真核生物基因表达调控的基本方式。除此之外，衣藻还拥有酵母没有的叶绿体，因此，在光照条件下衣藻能像高等植物一样进行光合作用。所以，在植物光合作用相关研究方面衣藻具备了得天独厚的优势。所以，衣藻凭借具有的核染色体、叶绿体和线粒体三套基因组，并兼备细菌这样原核生物的特点，成为目前唯一能特异地对细胞核基因组、叶绿体基因组和线粒体基因组进行稳定转化的真核生物。 1. 熟悉衣藻的生物学特点和作为遗传学实验材料的优势。 2. 学习并理解玻璃珠振荡的衣藻核遗传转化操作及其原理。 3. 掌握衣藻核遗传转化相关的实验操作方法。 4. 自学并了解衣藻细胞器遗传转化研究进展， 感兴趣的同学可以自行设计相关创新性实验。 三、实验材料与方法 （一）实验材料与试剂 （1）质粒供体为大肠杆菌（ E.coli ）DH5α菌株； 质粒受体为细胞壁缺陷的精氨酸依赖型莱茵衣藻CW15； 转化所用质粒为带arg7基因(精氨基琥珀酸裂解酶)的 PARG7.8Φ3（12kb）和带有arg7及atzA基因(阿特拉津） 的pCB740-atzA（12kb)。 （2）主要试剂（详见补充讲义）： E.coli培养用培养基、Amp。 质粒提取用SolutionⅠ、SolutionⅡ、SolutionⅢ。 衣藻细胞培养基TAP、精氨酸。 PCR相关酶与试剂、DNA琼脂糖凝胶电泳相关试剂。 （二）实验总流程图 酶切图 pARG7.8Φ3酶切图 1. 质粒pARG7.8φ3 2. EcoRI酶切pARG7.8 3. DL15000 共转化和直接转化表达外源目的基因 1.共转化载体质粒: pGenD-atzA (604kb); 带有atzA基因（1.4kb)。 2.直接转化载体质粒: pCB740-atzA（12kb)。 3.PCR检测所用引物: patzAup：5 - CAAACGCTCAGCATCCAG - 3 patzAdn：5 - TAGAGGCTGCGCCAAGCT - 3 四、讨论与思考题 1.衣藻遗传转化有哪些方法？不同方法的特点和优势是什么？ 2.一种表达或克隆在体在不同的宿主细胞中复制的基本条件有 哪些？ 3.若在原核和真核生物不同的系统中表达同一个外源基因，在 设计构建表达载体时应考虑哪些要素？ 4.若在转基因衣藻中为监测到目的基因转录物，试分析可能的 原因。 5.叶绿体遗传转化的研究意义、进展和存在的问题有哪些? 6.以3-4人为小组，自行设计以衣藻为材料的创新实验并与老 师讨论可行性。 * * 实验项目十二. 衣藻核遗传转化实验 —— 综合创新性实验 南开大学生命科学学院基础生物实验教学中心