细胞交替接触营养和空气.ppt

筛选原理 DNA的合成： 正常途径：糖、氨基酸——核苷酸——DNA ，可以被氨 基蝶呤阻断 胸腺嘧啶核苷激酶（TK） 补救途径：核苷酸前体 ——核苷酸——DNA 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT） 需要2种酶的参与 （1）氨基蝶呤可阻断细胞正常途径合成DNA，因此HAT培养基上的细胞不能采用该途径合成DNA。 （2）融合所用的瘤细胞一般是HPRT与TK缺陷型，因此也不能采用补救途径合成DNA。 两条途径被阻断后，有怎样的结果呢？ 瘤细胞（未融合的和多聚体）命运：因不能正常合成DNA而死亡。 融合细胞：具有亲代双方的遗传性能，具有来自于淋巴细胞内的HPRT与TK ，因此可利用培养基中的嘌呤与嘧啶采用补救途径合成DNA，因此可在HAT培养基中存活与繁殖。 5.克隆化培养 将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在0至数个细胞之间，培养一段时间后取上清以ELISA法选出抗体高分泌性的细胞。 找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后冻存、体外培养或动物腹腔接种培养生产抗体。 6.分泌抗体的融合细胞的筛选 酶联免疫吸附法（ELISA） EILSA主要是基于抗原或抗体能吸附至固相载体的表面并保持其免疫活性，抗原或抗体与酶形成的酶结合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理。 在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，形成的抗原抗体复合物，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。 7.单克隆抗体的大量生产 （1）实体瘤法 对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107cells／ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 ml。待肿瘤达到一定大小后(一般10～20天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mg／ml。 采血量有限。 （2）腹水制备法 腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。 腹水中单克隆抗体含量可达5～20mg/ml， 这是目前最常用的方法。 （3）生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产单抗 杂交瘤细胞 生物反应器 培养液 离心除去细胞，收集上清液提取抗体。 （五）人源化单克隆抗体简介 鼠源性单抗仍带有鼠抗原决定簇而使其应用存在一定的局限性： （1）不能有效地激活人体中补体和Fc 受体相关的效应系统 （2）被人体免疫系统所识别, 产生人抗鼠抗体( Human antigen mouse antibody,HAMA) （3）在人体循环系统中很快被清除掉。 通过人源化改造获得低免疫原性、高效性、人源性单克隆抗体，解决鼠杂交瘤单抗用于人体的变态反应的问题。 人—鼠杂交瘤：融合方法基本与鼠—鼠杂交瘤相同。亲本骨髓瘤细胞是小鼠骨髓瘤细胞，亲本B细胞则来源于人外周血淋巴细胞、淋巴结细胞、脾细胞。但是，人—鼠杂交瘤的人单克隆抗体分泌性能很不稳定，多数情况下杂交瘤会很快失去抗体分泌能力。 人—人杂交瘤：可通过建立人骨髓瘤或其他人细胞系与人淋巴细胞融合来制备人单克隆抗体。人源性融合亲本细胞需具有较高的融合率、产生的杂交瘤核型稳定并能产生一定量的具有特异性的抗体等特征。人—人杂交瘤核型稳定，然而遗憾的是可供利用的人类骨髓瘤细胞种类非常有限。 本节回顾 单克隆抗体 动物细胞培养主要是提供一个载体增殖的支撑技术，需要其他技术配合，才能高效制备相关产品 课外学习视频： 单克隆抗体制备 /u46/v_NDA2NTU5NDc.html 谢 谢！ * 球传球接种技术 将贴满细胞的微载体与新鲜微载体混合，实现细胞因随机碰撞而实现转移贴附在新载体表面的技术。 优点： （1）避免了细胞收获与微载体再生过程，方便、高效。 （2）防止细胞调亡：通过定期更换微载体也能为细胞的分裂生长提供了新的生长空间，在长期培养过程中保持细胞活力，延长了细胞寿命，提高了细胞分泌物的产量。 问题讨论： 微载体培养有哪些优点？ 优点 1.模拟了体内三维生长环境，减轻了接触抑制，可以多层生长。 2.很好地解决了生物反应器的空间分布问题，单位体积培养液的细胞产率高；培养系统占地面积和空间小；劳动强度小；放大容易，使大规模培养动物细胞成为可能。 3.把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；可以稍加改造利用传统生物反应器。 4.接种与收获方便；可循环、连续收获与培养，培养基利用率较高。 三、动物细胞培养的影响因素与培养工艺 细胞凋亡 （1）有毒物质或抑制因子产生 氨：来自培养基+代谢，积聚影响细胞生长。 乳酸：来自细胞的糖代谢，抑制乳酸脱氢酶，抑制糖酵解，能量产生减少，抑制细胞生长。 甲