[临床医学]1_COPD发病方法机制与主要研究方法.ppt

阻塞性肺气肿的发病机制 发病机制 ? 气道炎症 ? 氧化应激 蛋白酶/抗蛋白酶失衡 自主神经系统功能紊乱（如胆碱能神经受体分布异常） 气道炎症 氧化应激 香烟烟雾和其它吸入颗粒能产生氧化物：H2O2 ，脂质过氧化物，CO ,NO ? COPD患者内源性抗氧化物产生下降 COPD患者呼出气浓缩物、痰、血中氧化应激的标志物（如过氧化氢和 8- isoprostane）增加 血浆抗氧化能力下降 ? 氧化应激对肺组织的不利影响 激活炎症基因 使抗蛋白酶失活 刺激粘液高分泌 导致糖皮质激素的抗炎活性下降 蛋白酶/抗蛋白酶失衡 ? COPD患者肺组织中分解结缔组织的蛋白酶和 对抗此作用的抗蛋白酶之间存在失衡 ?弹性蛋白是肺实质结缔组织的主要成分，蛋白 酶引起弹性蛋白破坏，是导致肺气肿的重要原因，并且是不可逆的 ?肺气肿的形成主要与由巨噬细胞及其源性的基质金属蛋白酶起主导作用 COPD病理学特点 肉眼：肺脏过度膨大，失去弹性，灰白色。 一、肺脏的变化 气道改变 二、肺血管、心脏改变 COPD主要研究方法 小鼠 COPD 模型建立方法 小鼠肺功能检查 血浆、BALF 中细胞因子的 ELISA 测定 肺组织的免疫组织化学分析 待测标本的收集和处理 气道、肺组织病理形态学分析 蛋白电泳wester blot 琼脂糖凝胶电泳 RNA的提取及测定和Q-PCR 小鼠气道上皮细胞的提取与培养 小鼠腹腔巨噬细胞的提取 细胞培养基本技术胞培养基本技术 小鼠 COPD 模型建立方法 将小鼠随机分为COPD模型组和正常对照组，模型组（cigarette smoke exposed groups，简称 CS 组）小鼠每天熏烟两次，每次2 h，香烟剂量为10支／h。两次间隔时间为3-4小时）正常对照小鼠（normal control groups，简称正常组）不作任何干预，各组大鼠在相同环境下自由饮水和摄食模型制备期间，每星期称量一次体质量，每个月检测一次小鼠肺功能。对照组小鼠不做任何干预。熏烟满6个月后，行肺功能检测、气道、肺组织病理形态学分析 、蛋白的检测、血浆和BALF 中细胞因子的 ELISA 测定、肺组织的免疫组织化学分析（熏烟装置包括熏烟箱；通风装置；和监测熏烟箱内的温度，湿度，和气体（氧气，CO）浓度监测装置。） 小鼠肺功能评价 小鼠血浆的收集和血细胞涂片的制备 经小鼠眼球取出血液。抗凝血（枸椽酸钠抗凝）平衡后，在 4℃以 1500rpm离心 10min，将血浆分装后，-80℃保存备用。将 0.5ml 血细胞装于 15ml 用 3ml 双蒸水室温下悬浮二次（70 sec、30 sec）立即离心（条件同上）, 倒除血红蛋白等成份后, 将细胞悬浮于 1ml 培养液中(MEM, DMEM，199 均可), 吸取其中 100ul，用离心涂片机以 1500rpm离心 6min 制备细胞涂片 6 张以上，过夜后用锡铂纸包存于低温冰箱（-30℃） 小鼠肺组织病理学检查 准备小鼠肺组织石蜡切片 将小鼠腹腔麻醉后固定实验台上，取出血液标本后，打开胸腔，轻轻剪取右肺其中一小叶肺组织，于生理盐水中快速漂洗表面血迹后，置于4%多聚甲醛中进行固定24小时后取出，用清水快速将残留的甲醛冲洗干净，将标本进行梯度脱水后石蜡包埋，将包埋的肺组织切成月4um的薄片，置于40 ℃ 的温水中展开，用铺好胶的玻片将其捞起，将粘有蜡片的玻片在43 ℃ 烤片机上烤2H，待切片完全干透粘劳后，4 ℃ 保存备用。 H-E染色 1.二甲苯Ⅰ……………10min x2次 2,.无水酒精Ⅰ…………5min x2次 3.95%酒精Ⅰ…………5min 4.自来水洗……………5min 5.苏木素染液浸 5-10s 6.自来水冲洗直至发蓝为止 7.盐酸酒精(比例为1:99）洗10-20s 8.自来水冲洗10s 9.70%酒精……………5min 10.80%酒精……………5min 11.90%伊红乙醇洗5-10min 12.95%酒精…………5min 13.95%酒精…………10min 14.无水酒精Ⅰ…………10min x2次 15二甲苯10min3次 16.采用中性树胶封片 17.在37 ℃烤箱中过夜 18..显微镜下观察 小鼠肺组织病理学观察及形态 小鼠肺组织病理学观察及形态 免疫组化实验原理与意义? ?免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通?过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新?技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧?光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋?白质、多肽、