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第二节 其它重要的工具酶 DNA 聚合酶（DNA polymerase） DNA 聚合酶是催化以 DNA 或 RNA 为模板合成 DNA 的一类酶的总称。 经常使用的 DNA 聚合酶有大肠杆菌 DNA 聚合酶 I(全酶)、Klenow 酶、T4 DNA 聚合酶、T7 DNA 聚合酶、耐高温的 Taq DNA 聚合酶以及反转录酶等。 这些 DNA 聚合酶的共同特点是：它们都能够把脱氧核糖核苷酸(dNTP，包括 dATP、 dTTP、 dCTP 和 dGTP)连续的加到双链 DNA 引物链的 3-羟基末端上，催化核苷酸的聚合，形成新的 DNA 链。 DNA 聚合酶 I DNA 聚合酶 I 具有三种活性，即 5?→3?聚合活性、5?→3?外切活性和 3‘→5’外切活性。 DNA 聚合酶 I 要发挥作用需满足以下三个条件。 ① 底物和激活剂：DNA 聚合酶 I 催化聚合反应需要四种 dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)作为底物，同时Mg2＋是不可缺少的激活剂。 ② 带有 3?-端羟基末端的引物：DNA 聚合酶 I 所催化的聚合反应总是在引物的 3?-OH末端基团和搀入的 dNTP 之间发生的，且只能沿引物末端由 5?→3?方向延伸。 ③ DNA 模板：可以是 ssDNA 或 dsDNA，后者只有在其主链上有一至数个断裂的情况下才能成为有效的模板。 DNA 聚合酶 I 实验室中，利用 DNA 聚合酶 I，通过 DNA 缺口平移的方法制备 DNA 探针，可以用于核酸杂交分析。 双链 DNA 的单链缺口在 DNA 聚合酶 I 的 5?→3?外切作用下，从缺口的5‘端逐步水解核苷酸时，酶的聚合活性则利用缺口的 3’端游离羟基逐个加上相应的单核苷酸，使得缺口向下游移动，这种缺口移动的现象就称为缺口平移。 如果反应中使用的是用同位素标记过的单核苷酸底物，则合成产生的 DNA 分子即可作为带放射性标记的 DNA分子杂交探针。 DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow 片段) 是 E. coli DNA 聚合酶 I 的蛋白水解产物，特点是： 具有 DNA 聚合酶活性和 3?→5?核酸外切酶活性，但缺失了 5’→3’ 核酸外切酶活性。 Klenow 既保留了全酶的高保真性，又不会降解 DNA 5?末端。 用途：在基因工程中主要用于切口平移法标记 DNA，同时也可用于 DNA 的缺口补平和延伸。 DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow 片段) 用途： 用随机引物制备探针 补平5?突出端，形成平末端 切除3?突出端，形成平末端 合成cDNA第二条链 诱变反应中第二条链的合成 双脱氧法DNA序列测定 (Sanger 法) T4 DNA 聚合酶 在模板及引物存在的条件下，T4 DNA 聚合酶催化沿 5→3 方向合成 DNA。此酶还具有 3→5 外切核酸酶的活性，该活性比 DNA 聚合酶 I 强。与 E. coli DNA 聚合酶 I 不同，T4 DNA 聚合酶不具有 5→3 外切核酸酶活性。 T4 DNA 聚合酶 ■? 缺口填充 (无链置换活性)■? 产生平末端的最佳用酶■? 补平 5 突出端，形成平末端■? 切除 3 突出末端，形成平末端■? 通过置换合成法标记探针■? 单链删除后亚克隆■? 基因定点突变中第二条链的合成 DNA片段的末端平滑化示例 T7 DNA 聚合酶 T7 DNA 聚合酶是从受 T7 噬菌体感染的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种复合形式的核酸酶。 它由两种亚基组成：一种是 T7 噬菌体基因 5 编码的蛋白质，其分子量为84 kD；另一种是大肠杆菌编码的硫氧还蛋白(thioredoxin)，其分子量为 12 kD。 T7 DNA 聚合酶 T7 DNA聚合酶是目前已知的持续合成能力最强的 DNA 聚合酶，能连续合成数千个核苷酸。 除聚合活性以外，T7 DNA 聚合酶还具有单链和双链的 3‘→5’外切酶活性，它的活性也很强，约为 Klenow 酶的 1000 倍。 T7 DNA 聚合酶不具有 5‘→3’外切酶活性。由于 T7 DNA 聚合酶的高度续进性和不受 DNA 二级结构的影响，在分子生物学中常被用于长模板 DNA 的引物延伸反应。同时，经修饰的 T7 DNA 聚合酶还是双脱氧终止法对长片段 DNA 进行测序的理想工具酶。 碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase） 碱性磷酸酶是一类能特异性地切去DNA或RNA的5‘-磷酸基团的工具酶，它们的作用底物可以是ssDNA或dsDNA或RNA，也可以是NTP或dNTP。 用途 1）去除DNA片段的5’-末端的磷酸基。防止线状DNA的自身环化（Self-Ligation）。 2）除去PCR反应后残存的dNTP。PCR产物进行测序时，在反应体系