有关物质方法建立与验证.docVIP

有关物质检查方法学建立 以下内容适用于有较强的紫外吸收、用常规反相色谱法可良好分离的被测物的纯度检查。以常用的C18和C8柱为例。 1、溶解度考察 考察被测物在水、甲醇、乙腈、冰醋酸、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等几种常用溶剂中的溶解度，判断被测物极性强弱。 2、紫外光谱绘制 考察被测物在水、甲醇、乙腈等常用溶剂中的紫外吸收情况，一般选取最大吸收波长作为流动相选择时的检测波长。几种被测物最大吸收波长不一致时，选取共同吸收较大的波长。 3、流动相的选择 ①中性成分 被测物为中性成分时，一般选择甲醇-水、乙腈-水、四氢呋喃-水三种系统。乙腈-水系统由于粘度小，通常可以得到良好的柱效。此外，乙腈的紫外末端吸收比甲醇小，在低波长处检测基线波动小，测定误差小。 被测物为极性较大的中性成分时，系统中甲醇或乙腈的比例可适当小些。被测物为极性较小的中性成分时，可适当增大甲醇或乙腈的比例。 ②碱性成分 向流动相中加入胺类扫尾剂。常用三乙胺、二乙胺、乙二胺、正丁胺等。 加入反离子，常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠及十二烷基磺酸钠。高碳数离子对试剂使保留时间过长，可更换低碳数的离子对试剂。流动相的pH一般为3~5。 ③酸性成分 向流动相中加入少量弱酸，常用甲酸、醋酸。适用于分离3≤pKa≤7的弱酸。 加入反离子，常用的离子对试剂为四丁基季胺盐及四丁基磷酸盐等。流动相的pH一般为7~7.5。 4、流动相的要求 被测物之间分离良好，分离度达到1.5以上。主成分保留时间以10分钟为宜。分析时间通常为主成分保留时间的2~3倍。分析时间过长的可考虑采用剃度洗脱。 5、检测波长的再确定 以选定的流动相为溶剂，考察被测物的紫外吸收情况。有DAD检测器的，考察主成分峰纯度，应达到98%以上。综合以上考察结果，将检测波长作修正。 6、供试品溶液浓度的选择 配制一系列不同浓度的溶液，在不过载的前提下确定浓度的增加不再引起杂质增加的拐点浓度。 配制已知原料、中间体、杂质等的稀溶液，确定其检测限与定量限。通常以0.1%计，反推得供试品溶液的最低浓度。 综合以上考察结果，以柱效最优作考量，确定供试品溶液的浓度。 7、方法学验证 ①准确度 对于有定量要求的杂质要通过回收率试验验证方法的准确度。例如某杂质的限度为0.2%，可分别配制该杂质浓度为0.1％、0.2％和0.3％的杂质溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收率数据的相对标准差（RSD）。各浓度下的平均回收率均应在80%-120%之间，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%，相对标准差应不大于10%。 ②线性 适用与有定量要求的杂质检查。在定量限至一定的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定该杂质峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.990，Y轴截距应在100％响应值的25％以内，响应因子的相对标准差应不大于10%。 ③精密度 适用与有定量要求的杂质检查。 重复性 配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于15%。 中间精密度 配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于20%。 ④专属性 空白对照应无干扰，主成分峰或需定量的杂质峰与其它峰应能完全分离，分离度不得小于2.0。 强制降解试验 考察主成分在酸、碱、高温、强光、氧化等因素影响下的稳定性。对固体状态的被测物而言，一般还需分别考察在固体和溶液状态下的稳定性。要求降解产物与主成分或需定量的杂质峰完全分离。 酸降解试验 一般选择0.1N的盐酸，在室温或加热条件下进行考察。 碱降解试验 一般选择0.1N的氢氧化钠溶液，在室温或加热条件下进行考察。 高温降解试验 分别在固体和溶液状态下进行考察，可分别在60、80℃考察30天，或在130℃考察8小时。 光降解试验 分别在固体和溶液状态下进行考察，例如，可先经一百二十万勒克斯（Lx）×小时的冷白荧光灯照射，再经200瓦小时/平方米的紫外荧光灯照射。 氧化降解试验 主要在溶液状态下进行考察，氧化剂可采用不同浓度的双氧水，分别在室温或加热条件下进行考察。同时须进行双氧水的空白试验。 ⑤检测限与定量限 杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。 杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于2.0%，峰面积的相对标准差应不大于5.0%。 ⑥耐用性 分别考察流动相比例变化±5