脱氧核糖核酸DNA的制备.PDFVIP

脱氧核糖核酸 D（NA.）的制备 王 尔 中 （中国科学院动物研究所） 在实验生物学的研究中，DNA的制备已 缓冲液中。 成为一种常用的方法。根据实验材料和研究目 二（）非离子性乳化荆溶胞法[t]［ 的不同，所用的制备方法也不同。本文主要介 此方法是用轻度溶胞法，可以使细菌细胞 绍质粒 DNA和其它 （动物组织、细菌）DNA 的染色体 DNA仍然与细胞膜结合在一起，这 常用的制备方法。 样就能在低速离心中将染色体DNA与质粒 DNA分开。 一、质粒DNA的制备 非离子性乳化剂多氧乙烯十六烷醚 （即Brij 质拉 (plasmid）是共价闭合环状的超螺旋 58)，可以用来分离质粒DNA。通常所使用的 DNA。它的碱基比例与染色体 DNA不同，质 蔗糖缓冲液和溶菌酶制备的细菌球形体，在脱 粒 DNA分子量小，而染色体DNA分子量大。 氧胆酸盐 D（OC）和 EDTA存在的情况下，加 根据这些特点，研究人员采用一些实验技术进 人 Brij58溶胞，在低速离心中绝大部分 9（0外） 行提取纯化。常用的方法有以下几种。 的染色体DNA会沉降下来，而质粒DNA保 （一）Hirt改良法 持在上清液中。因为脱氧胆酸盐可以分解细胞 此方法可以用来提取质粒 DNA或分子量 膜的脂蛋白或脂多糖，因此质粒DNA可以与 小的DNA 如（噬菌体、病毒或线粒体DNA)o 细胞膜分离。这一方法广泛应用于分离质粒 将细菌培养到3X105细胞／毫升浓度 5（90 DNA与染色体 DNA. mll处‘0·D约为0.6-0.8)040C,600g离心10 三（） 质粒DNA的提纯方法 分钟收集菌体。然后重新悬浮于5倍体积的10 一般地说，上述两种方法分离的质粒DNA mMTris-HC1pH8.0,1mMLDTA缓冲液中。 都比较粗放，需进一步纯化。常用的纯化方法 轻轻摇动混合，加20毫克／毫升的链霉素蛋白酶 有以下三种。 K，使最终浓度到50微克／毫升。然后再加10务 1．两相法[2［l 的SDS，使最终浓度达1多。在37℃下保温30分 此方法是继冷酚法抽提之后，用酒精沉淀 钟，然后慢慢加人4M氯化钠，使最终浓度为 出DNA 还（包括各种RNA)。它是一种专门 1M此（步骤必须边加边摇），混合均匀，再于4cC, 提取闭合环状双链 DNA的快速方法之一。 放置过夜。过夜后，在40C,10000g离心30分 在供试DNA悬液中加人少量IOmMTris- 钟，取上清液，加入等体积的三氯甲烷一异戊醇 HCI,pH8.0,1mMEDTA缓冲液。在 100℃加 (24:1)混合液，再加入等体积90%的苯酚，00C 热2分钟后，迅速放入干冰一酒精溶液中冷却。 下搅拌30分钟，再置于40C,1500g离心10分 然后加2-，倍体积的葡聚糖500(16.8多W/ 钟。吸出水相层，加二倍体积冷乙醇(-20cC), W),1.25倍体积的聚乙二醇6000(18.4多W/ 于一20℃放置过夜。过夜后，在一100c,1oooog W）和十分之一体积的0.5M磷酸钠缓冲液pH 离心10分钟。 将沉淀溶于少量 pH8.1的10 6.8,温度保持在40C。然后再加水，使体积成 m.M Tris-HCI,50mM氯化钠、0.1mMEDTA 为原体积的，倍。充分混匀，在4℃下低速离 32 心，回收含有过量聚乙二醇的上清液。加入氯 中）。40C、匀浆3分钟，1000g离心1，分钟，弃 化钠，使最终浓度为0.2A1后，加二倍体积的酒 去上清液 （此步骤重复两次）。沉淀加9毫升缓 精，使 DNA沉淀。沉淀用75多的酒精洗后， 冲液，用磁力搅拌器搅匀，再加九分之一体积的 溶解于缓冲溶液中。