[医学]CHAPTER 5 聚合酶链式反应体外扩增DNA.pptVIP

3. 克隆化的PCR产物连入T载体 T载体有与A碱基互补的未配对3’T碱基。 T载体可用以下三种方法构建： 1. 可用限制性内切核酸酶如XcmI、HphI与MboII酶切产生3’末端未配对T碱基。 2. 应用末端转移酶与双脱氧TTP加入一个突出的T残基到线性化载体的3’末端。 3. 应用不依赖于模板的Taq DNA聚合酶的末端转移酶活性在线性化载体的3’末端处的羟基基团上催化连接上一个T碱基。 克隆化的PCR产物连入T载体的方法 1. 在一只微量离心管内，依次加入下列连接混合液 PCR扩增的目的DNA 3 μl T载体 0.5μl 10 ×连接缓冲液 1 μl 噬菌体T4DNA连接酶 1 μl 用H2O补足至 10 μl 2. 将连接混合液在14℃温育4h。 3. 取连接反应后的混合液适量，转化大肠杆菌感受态细胞。 克隆化的PCR产物连入T载体的方法 4. 将转化的细胞涂布在含有抗生素、IPTG和X-gal的固体培养平板上。 5. 过夜培养后，挑取白色菌落，进行培养。 6. 提取质粒DNA。 7. 用相应的限制性内切核酸酶进行酶切鉴定，或用PCR进行鉴定。 8. 通过琼脂糖凝胶电泳鉴定克隆DNA片段的大小。 9. 通过测序来分析PCR扩增片段的正确性。 4. 通过PCR扩增在扩增DNA末端引入限制性内切酶酶切位点 用于PCR扩增的寡核苷酸引物的5’末端常被设计加入相应的内切酶酶切位点。 扩增产生的目的片段的双末端被引入新的酶切位点经酶切消化后的扩增片段能定向克隆至相应的载体。 用相应的内切酶消化纯化后的扩增片段与载体连接，将连接液转化大肠杆菌，即可完成克隆。 通过PCR扩增在扩增DNA末端引入限制性内切酶酶切位点 通过PCR扩增在扩增DNA末端引入限制性内切酶酶切位点 1. 设计带有限制性酶切位点的正向和反向引物，进行PCR扩增。 2. 电泳检查PCR扩增结果。如果PCR产物电泳检查有多条带，可通过低熔点琼脂糖纯化目的条带，纯化产物溶于TE。 3. 取约100ng 纯化后的PCR产物，在20μl酶切体系中加入适量限制性内切核酸酶进行酶切消化。 通过PCR扩增在扩增DNA末端引入限制性内切酶酶切位点 4. 消化结束后，用酚氯仿和氯仿各抽提一次。 5. 转移反应液上层水相至一个新的离心管中，加入3 mol/L 乙酸钠至终浓度为0.3 mol/L，加入2倍体积的乙醇，在-20℃贮存30min。 6. 4 ℃高速离心5min，使DNA沉淀，弃上清，然后用70%乙醇洗涤沉淀，溶液再离心，弃上清，将DNA沉淀在空气中晾干数分钟。 7. 将DNA样品溶于10 ℃水中。 通过PCR扩增在扩增DNA末端引入限制性内切酶酶切位点 8. 在一只微量离心管内，依次加入下列试剂： PCR扩增的目的DNA 3 μl 质粒DNA 1μl 10 ×连接缓冲液 1 μl T4DNA连接酶 1 μl 用H2O补足至 10 μl 9. 将上述连接反应混合液在16℃温育4h。 10. 取连接反应后的混合液适量，转化大肠杆菌感受态细胞。 11. 将转化的细胞涂布在含有抗生素、IPTG和X-gal的固体培养平板上。 12. 过夜培养后，挑取白色菌落，进行培养。 13. 提取质粒DNA。 14. 用相应的限制性内切核酸酶进行酶切鉴定，或用PCR进行鉴定。 15. 通过琼脂糖凝胶电泳鉴定克隆DNA片段的大小。 16. 通过测序来分析PCR扩增片段的正确性。 通过PCR扩增在扩增DNA末端引入限制性内切酶酶切位点 5. 应用mRNA反转录扩增cDNA（RT-PCR） RT-PCR是一种从RNA扩增cDNA拷贝的方法。 可以构建cDNA文库，也可以测定基因表达的强度。 第一步为酶促催化使RNA反转录为cDNA第一链。一条寡核苷酸引物先与mRNA杂交，然后由RNA依赖的DNA聚合酶催化合成互补的cDNA，后者能进一步用于PCR扩增。 应用mRNA反转录扩增cDNA（RT-PCR） 单链cDNA第一链合成的引物可用基因特异性引物（GSP）、Oligo(dT)和一种随机六核苷酸序列进行引导。 1. Oligo(dT)能与哺乳动物mRNA的内源